乳酸菌代谢物中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选

2022-09-07崔方超韩瑜娟李婷婷赵贵琴励建荣劳敏军于建洋郭晓华

中国食品学报 2022年8期

崔方超，韩瑜娟，李婷婷，赵贵琴，励建荣*，林洪，劳敏军，于建洋，郭晓华，王轰

（1 渤海大学食品科学与工程学院生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州 121013 2 大连民族大学生命科学学院辽宁大连 116600 3 中国海洋大学食品科学与工程学院山东青岛 266100 4 浙江兴业集团有限公司浙江舟山 316022 5 荣成泰祥食品股份有限公司山东荣成 264300 6 山东美佳食品股份有限公司山东日照 276800 7 蓬莱京鲁渔业有限公司山东烟台 264000）

随着我国经济水平的飞速发展，国民饮食结构发生了显著变化，其中以高能量、高嘌呤类食物摄入显著增加为特征。在人体内的代谢途径中，嘌呤类物质在黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）的催化作用下最终转化为尿酸。XOD 活性过高或患有代谢系统疾病会使尿酸大量累积，进而引发运动功能受损、高尿酸血症和痛风，长期高尿酸血症还可诱发高血压、糖尿病、冠心病、肾衰竭等疾病[1]。随着高尿酸血症和痛风病发率呈逐年增加且年轻化的趋势，高尿酸血症成为继“三高”之后的第4 个危险因素[2]。

目前，对痛风的治疗主要从两方面入手：一方面是抑制尿酸的生成，另一方面是促进尿酸的排泄。抑制尿酸生成是通过抑制腺苷脱氨酶（Adenosine Deaminase，ADA）和XOD 的活性达成，它们是催化并调控尿酸生成的关键酶。促进尿酸排泄是通过调控尿酸转运蛋白的表达来完成，抑制其在肾脏的重吸收，减少尿酸在血液中的积累，降低血清尿酸水平[3]。其中对XOD 的抑制研究较多，在临床治疗中，别嘌呤醇、非布司他等已被广泛用于痛风、高尿酸血症等的治疗，然而这些药物具有较大的副作用，如引起患者肝功能损害，出现头痛、胃肠道疾病以及腹泻等不良症状[4]。关于植物活性物质抑制XOD、降低尿酸含量的研究主要集中在多酚、黄酮和皂苷类物质。多酚类物质如葛根素[5]、山奈酚（木犀草素）[6]、芥子酸[7]、阿魏酸[7]、丁香酸[7]、绿原酸[8]、咖啡酸[9]等都具有明显XOD 抑制性。黄酮类物质如槲皮素[10]、黄芩苷[11]也具有相同功效。皂苷类物质如穿山甲总皂苷[12]，是从药材穿山甲中提取的可抑制XOD 的活性成分。

由于活性肽具有分子质量小，容易被人体吸收等优点，近些年作为抑制剂成为新的研究热点。Li 等[13]以核桃蛋白衍生肽为研究对象，对其体外XOD 抑制活性及其机制进行研究，结果表明：含色氨酸（Trp）的核桃蛋白源肽能有效抑制XOD，Trp 数量的增加可显著提高肽的XOD 抑制活性，且含Trp 的肽具有很好的抗氧化活性。He 等[14]从金枪鱼蛋白水解物中分离出13 种二肽和三肽，采用高效液相色谱法验证了它们的XOD 抑制活性，结果表明：含苯丙氨酸（Phe）的肽比含Trp 的肽具有更高的XOD 抑制活性，其中Phe-His 的XOD抑制活性最高。赵谋明等[15]通过酶解金枪鱼制备XOD 抑制肽，得到XOD 抑制率为30.96%的金枪鱼酶解物。邹琳[16]从鲣鱼酶解物中分离得到具有XOD 抑制作用的五肽，人工合成此五肽证实其具有较强的XOD 抑制活性，分子对接结果显示其能够进入XOD 中含Mo 原子的活性中心，并通过氢键、疏水相互作用及范德华力等与活性中心周围的氨基酸残基产生相互作用，与黄嘌呤之间存在竞争性抑制作用。

益生菌不仅能够促进人体健康，而且能改善食品属性，被越来越多地应用于食品工业。陈沈梁等[17]从泡菜中分离得到56 株乳酸菌，研究其对嘌呤核苷的降解能力，最终筛选到1 株具有高效降解嘌呤核苷的乳酸菌，进一步的试验证明此菌株为短乳杆菌，具有耐胆盐、耐酸以及耐受饱腹人工胃肠液的能力，这为进一步研发功能性乳酸菌食品提供了理论依据。邓英等[18]用短乳杆菌DM9218干预高果糖饮食诱导的高尿酸血症小鼠，结果表明：短乳杆菌DM9218 一方面可以通过改善肠屏障功能，降低内毒素水平，从而缓解XOD 的表达及活性，另一方面由“肝-肠循环”直接降解肌苷，从而影响血清尿酸水平。牛春华等[19]从5 株植物乳杆菌中筛选出1 株UA149，具有较强的嘌呤核苷降解能力，能够显著降低高尿酸血症模型大鼠血尿酸水平，降低血清XOD 活性，同时降低白三烯、血栓素和炎症因子水平，可应用于高尿酸血症的预防和辅助治疗。

目前研究较多的是益生菌自身对高尿酸血症的影响，而对益生菌代谢产物的研究相对较少。本文将研究乳酸菌代谢产物对XOD 的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸菌 NRRLB-14768、IMAU 4005、NCL 13、SC 3-2-1、DLL-500 均为实验室自主分离鉴定的乳酸菌菌株。

MRS 肉汤、黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤标准品，北京索莱宝科技有限公司；甲醇（色谱纯级），上海麦克林生化科技有限公司；冰乙酸（色谱纯级）、十二烷二酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四丁基氢氧化铵离子对试剂（色谱纯级），上海迈瑞尔公司；二氢咖啡酸，北京天威泰达科技有限公司；4-十二烷基苯磺酸，上海贤鼎生物科技有限公司；16-羟基棕榈酸，北京格瑞通达科技有限公司；其它试剂（均为分析纯级）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-75KBS 立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD 超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；THZ-D 台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；Multifuge X1R 高速冷冻离心机，赛默飞世尔（中国）有限公司；LC-2030高效液相色谱仪岛津，日本岛津公司；MS105DU电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；DK-8D 电热恒温水槽，上海-恒科学仪器有限公司；imark 酶标仪，美国BIO-RAD；分子模拟软件Discovery Studio （DS）2017 R2 Client，美国Accelrys 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化取-80 ℃冰箱保存的菌种，以2%接种量接种于10 mL MRS 肉汤培养基中，37℃培养16 h 左右。以2%接种量依次传代，取第2代培养液1 mL 于50 mL 培养基中扩大培养。

1.3.2 乳酸菌代谢产物的获得取第3 代培养液30 mL 于离心管中，4 000 r/min 离心10 min，收集上清液，经细菌过滤器（0.22 μm）过滤，所得无菌滤液即为乳酸菌的代谢产物[20]，将无菌滤液在95℃高温条件下灭酶10 min 备用。

1.3.3 乳酸菌代谢产物抑制XOD 效果验证参考宋敏杰[21]的方法稍作修改，准确称取0.0100 g黄嘌呤标品用超纯水溶解，并用1 mol/L 的NaOH助溶，用50 mL 的容量瓶定容，配制成质量浓度为200 μg/mL 的标准溶液备用。随后所需溶液均用超纯水进行稀释，所有待测样品过0.22 μm 滤膜，在特定的色谱条件下进行嘌呤含量的测定，从而确定代谢产物对XOD 抑制效果。

色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse C18 Plus（4.6 mm×250 mm × 5 μm）；流速0.5 mL/min；柱温40 ℃；进样量10.0 μL；检测波长254 nm。将超纯水、冰乙酸、四丁基氢氧化铵按体积比997∶1.5∶1.5 混合作为流动相C，再与甲醇（流动相B）按95∶5 混合作为最终流动相。

试验设计如下：空白组为黄嘌呤（880 μL）+磷酸盐缓冲液（120 μL）；对照组为黄嘌呤（880 μL）+磷酸盐缓冲液（40 μL）+XOD（80 μL）；试验组：黄嘌呤（880 μL）+无菌滤液（40 μL）+XOD（80 μL）。试验所用黄嘌呤质量浓度均为50 μg/mL，XOD 为0.1 U/mL，XOD 作用时间为30 min，反应温度为35℃，反应结束后，需将反应管放在95 ℃水浴灭酶10 min，灭酶后用高效液相色谱法检测体系中黄嘌呤的含量。为排除空白培养基的影响，将无菌滤液换成等量的培养基进行验证。

1.3.4 乳酸菌代谢物成分的搜集通过对在线数据库PubChem（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）以及已经出版的文献进行检索，对无菌滤液中的化学成分进行收集、整理。对搜集的化学物质进行优化，包括2D 结构转化为3D 结构，加氢、能量最小化以及添加HRRMM 力场，建立无菌滤液所含成分3D 结构的化合物库。

1.3.5 抑制剂特性研究

1.3.5.1 pH 值排除试验由于乳酸菌发酵会产生大量的乳酸、乙酸等酸类物质，从而使上清液的pH 降低，为排除pH 值对XOD 活性的影响，对上清液的pH 值进行检测。

1.3.5.2 有机酸排除试验为确定有机酸是否为抑制XOD 的活性物质，将乳酸菌上清液使用1 mol/L NaOH 调节pH 为7，采用高效液相色谱法测定中和后的乳酸菌上清液对黄嘌呤氧化酶的抑制作用[22]。

1.3.6 分子对接分子对接可以通过研究分子间相互作用从而预测分子间的结合方式，因而被广泛地应用于分析小分子配体与蛋白相互作用的结合机制以及进行抑制剂的筛选。参考Li 等[23]的方法，进行适当调整。从RCSB 蛋白质数据库（http：//www.rcsb.org/pdb）选择XOD 的3D 结构（PDB ID：3NVY），去水加氢，修复不完整残基，删除配体，准备分子对接。

XOD 的X 射线晶体结构表明，它有两个对称相关的结构域单体，是以同型二聚体形式表示的氧化还原酶，每个单体都包含一个C-末端的钼（Mo）结构域，包括4 个氧化还原中心、1 个中心黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子和1 个具有两个铁硫中心的N-端结构域。XOD 含有两个分离的底物结合位点，Mo 中心和FAD 中心。黄嘌呤的氧化发生在Mo 中心，底物氧的还原发生在FAD 中心，转移电子产生超氧阴离子（O2-）或过氧化氢（H2O2）自由基[11]。

3NVY 是牛乳中的XOD 与槲皮素相结合的复合晶体结构，张岑等[24]研究发现，槲皮素通过占据底物黄嘌呤进入XOD 活性中心的通道，抑制了XOD 对黄嘌呤的催化，从而减少了尿酸的生成。在本次分子对接过程中选择槲皮素所在位置作为结合位点，即活性位点AC5。该结合位点共有18个氨基酸残基结合位点：Phe1150、Ser1008、Ala1079、Arg880、Thr1010、Phe1009、Phe914、Ser876、Leu1014、Leu873、Leu648、Val1011、Phe649、Phe1013、Lys771、Pro1076、Glu802、Ala1078 在该结合位点处能与这些氨基酸残基结合，则有抑制XOD 的可能性。

图1 XOD 与槲皮素结合活性位点2D 示意图Fig.1 2D schematic diagram of XOD binding active site with quercetin

将得到的XOD 晶体结构导入分子模拟软件DS 中，并对其进行分子对接前的去水、加氢等一系列准备操作。从NCBI 数据库中收集酸类代谢产物的3D 结构，并将3D 结构作为配体，进行能量最小化，并建立分子库。

以3NVY 作为受体蛋白，以乳酸菌代谢物为配体，以原配体结合作用位点（X：36.3141，Y：11.793，Z：17.8448）为对接中心，以15 为对接半径，采用配体对接工具栏的半柔性对接，并且设置参数为刚性优化、快速筛选，其余设置为默认值进行分子对接。按打分将筛选出的乳酸菌代谢产物进行下一步操作。

1.3.7 黄嘌呤氧化酶抑制效果验证对比已经研究出的具有XOD 抑制活性的物质所具有的结构，并结合分子对接的打分，选出打分较高的物质通过高效液相色谱法进行活性验证，以黄嘌呤转化量反映酶活性变化，通过梯度浓度反应探索抑制率与抑制剂之间的关系。用880 μL 黄嘌呤（50 μg/mL）与80 μL XOD（0.1 U/mL）反应作为对照，在反应体系中分别加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg/mL 的标准品40 μL，根据加入标准品后对整个反应体系中黄嘌呤转化量的影响确定其抑制作用。整个反应体系在35 ℃下反应30 min，随后在95 ℃条件下水浴10 min 进行灭酶。用1.3.3 节的色谱条件进行等度洗脱检测。抑制率计算公式为：

1.3.8 数据处理使用Excel 2010 及OriginPro 8.5 对试验中的数据进行整理分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌代谢物对XOD 抑制效果验证

由图2可知，在设定的液相条件下，黄嘌呤的出峰时间为6.596 min，其峰面积为3 294 685；在相同条件下加入80 μL XOD 后黄嘌呤的峰面积明显减小（峰面积为1 821 383），说明在该反应条件下XOD 具有良好的酶活，能够催化黄嘌呤。在相同反应体系中分别加入40 μL NRRLB-14769、IMAU 4008、DLL-500、NCL 13、SC 3-2-1 5 株乳酸菌的代谢产物后黄嘌呤的峰面积分别为3 222 677，3 099 157，3 096 238，2 415 234，2 161 694，可以看出5 株乳酸菌的代谢产物均对XOD 具有明显的抑制作用，且抑制效果大小为NRRLB-14769>IMAU 4008>DLL-500>NCL 13>SC 3-2-1，其中菌株NRRLB-14769、IMAU 4008和DLL-500 的代谢产物对XOD 的抑制效果较强。由此可以得出不同乳酸菌代谢物对XOD 抑制性有显著差异，可能是不同的乳酸菌所产生的代谢物质及其含量不同影响对XOD 的抑制率。

图2 不同乳酸菌代谢产物对XOD 的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of different metabolites of lactic acid bacteria on XOD

从图3中可以看出，与不加XOD 组相比，加入XOD 组黄嘌呤的含量显著减少。加入空白培养基的试验组与对照组相比，黄嘌呤的含量没有明显变化，说明空白培养基不含有抑制XOD 的活性成分，从而说明是乳酸菌代谢产物抑制了XOD活性。

图3 培养基对XOD 的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of culture medium on XOD

2.2 乳酸菌中代谢产物成分收集

通过文献收集、整理、分析，共得到乳酸菌的代谢产物76 种（见表1）。目前，乳酸菌及其代谢产物在食品行业有广泛的应用，如发酵乳制品、肉制品、泡菜、酒类饮料等，是生产中非常重要的发酵剂和风味物质。乳酸菌发酵代谢的最终产物包括多种酸类物质（乳酸、乙酸、甲酸）和乙醇等[25]，具体成分因菌种不同有较大差异，本文主要研究乳酸菌的胞外代谢物。从表1中可以看出，乳酸菌代谢物除有机酸外，还含有一些氨基酸、嘌呤和嘧啶类物质为乳酸菌生长所需要的物质，另外甜菜碱、对香豆酸、别嘌呤醇是经研究证明具有XOD抑制活性。

表1 乳酸菌代谢产物Table 1 Lactobacillus metabolites

2.3 抑制剂特性研究

乳酸菌代谢会产生大量的酸性物质，使上清液呈现酸性环境，为排除pH 值对XOD 活性的影响，对上清液的pH 值进行了检测，结果显示上清液的pH 值为4.20～4.9，有文献[30]表明，在此pH 值条件下，XOD 的活性不受影响，说明导致XOD 活性降低的物质来源于乳酸菌代谢产物。使用氢氧化钠溶液将上清液的pH 值调至中性，研究上清液对XOD 的抑制作用。从图4可以看出中和后的上清液对XOD 没有抑制作用，而没有中和的上清液对XOD 具有明显的抑制作用，判断对XOD 产生抑制作用的是有机酸类物质。

图4 pH 值对XOD 活性的影响Fig.4 Effect of pH value on XOD activity

2.4 有机酸类物质XOD 分子对接结果

已经判断出上清液中的有机酸类物质抑制了XOD 活性，将表1中的有机酸与XOD 进行分子对接，并且选择打分较高的几个物质进行验证。从表中可以看出3，4-二羟基苯基丙酸（Dihydrogen caffeic acid，DHCA）、16-羟基十六烷酸、十二烷二酸（Dodecanedioic acid，DDA）、4-十二烷基苯磺酸这4 种物质与XOD 分子对接打分较高，处于前列。

化合物需要与XOD 结合后，才能产生正向或反向的作用，基于此分析DHCA、16-羟基十六烷酸、DDA、4-十二烷基苯磺酸等化合物在分子对接过程中与XOD 的结合形式。图5为4 种化合物与XOD 结合后的2D 可视化分析图。

图5a 为DHCA 和XOD 的相互作用模式图，其中DHCA 与XOD 的氨基酸残基Ser876、Val1011、Ala1079 以及XOD 中心Mos1328 之间形成氢键相互作用，并与Val1011 之间形成疏水相互作用。图5b 为4-十二烷基苯磺酸与XOD 相互作用模式图，其中4-十二烷基苯磺酸与XOD 的氨基酸残基Lys771 之间形成氢键相互作用，与Leu1014、Ser876 之间形成疏水相互作用。图5c 为16-羟基十六烷酸与XOD 的相互作用模式图，其中16-羟基十六烷酸与XOD 的氨基酸残基Arg880 之间形成氢键相互作用。图5d 为DDA 与XOD 的相互作用模式图，其中DDA 与XOD 的氨基酸残基Asn768、Ala179 以及 XOD 中心Mos1328 之间形成氢键相互作用。以上小分子与黄嘌呤氧化酶之间形成的化学键有助于小分子发挥作用，从而对酶产生一定的促进或抑制作用。

表2 分子对接结果Table 2 The results of molecular docking

图5 二氢咖啡酸-XOD（a）、4-十二烷基苯磺酸-XOD（b）、16-羟基十六烷酸-XOD（c）和十二烷二酸-XOD（d）Mo中心结合位点2D 模式图Fig.5 2D pattern diagram of Mo binding sites of DHCA-XOD （a），4-dodecyl benzene sulfonic acid-XOD （b），16-hydroxyhexadecanoic acid-XOD （c） and DDA-XOD （d）

2.5 黄嘌呤氧化酶抑制效果的验证

从图6中可以看出，16-羟基十六烷酸和DHCA 对XOD 的抑制率都是呈先上升后下降的趋势，其中16-羟基十六烷酸在质量浓度为0.4 mg/mL 时达到最大抑制率（90%），DHCA 在质量浓度为0.5 mg/mL 左右时达到最大抑制率（约为67%）。16-羟基十六烷酸又称16-羟基棕榈酸，在此处表现出很强的XOD 抑制能力，这可能与棕榈酸具有抗氧化性[31]相关，16-羟基十六烷酸作为棕榈酸的衍生物可能也具有抗氧化活性。DHCA 表现出良好的XOD 抑制作用，同样与其很强的抗氧化能力有关。据报道，酚类化合物具有减少自由基形成的特性，其中咖啡酸对氧自由基的生成具有良好的抑制作用，具有较强的DPPH 自由基清除能力，并且咖啡酸能在一定程度上抑制XOD 活性[9，32]。从图6中可以看出十二烷二酸和4-十二烷基苯磺酸对XOD 的抑制作用呈现剂量依赖性，随着抑制剂质量浓度的升高，抑制率也在增加，十二烷二酸的抑制率最终会趋于平缓，而4-十二烷基苯磺酸的抑制率缓慢上升。

图6 16-羟基十六烷酸（a）、DHCA（b）、DDA（c）、4-十二烷基苯磺酸（d）的抑制曲线Fig.6 Inhibition curve of 16-hydroxyhexadecanoic acid （a），hydrocaffeic acid （b），dodecanedioic acid （c）and 4-dodecylbenzenesulfonic acid （d）

3 总结

本文选取实验室保藏的5 株乳酸菌，对菌株上清液XOD 抑制性进行验证。结果显示，5 株菌上清液对XOD 均具有良好的抑制效果并且抑制能力大小为：NRRLB-14769>IMAU 4008>DLL-500>NCL 13>SC 3-2-1。进一步试验证明上清液中的有机酸类物质抑制了XOD，利用Discovery Studio 2017 R2 Client 将有机酸类代谢产物与XOD 的晶体结构进行对接。根据分子对接的结果，选择了DHCA、16-羟基十六烷酸、十二烷二酸、4-十二烷基苯磺酸4 种物质对XOD 的抑制效果进行了验证，结果表明这4 种物质都对XOD 具有不同程度的抑制作用，其中16-羟基十六烷酸表现出良好的XOD 抑制作用。