蜜蜂遗传育种新技术（二）——分子遗传标记

薛运波│文

分子标记技术以其共显性、多态性和准确性等优点已广泛应用于动植物的遗传学研究，常用的分子标记包括以分子杂交为基础的RFLP标记和ISH标记，以简单重复序列为基础的SSR标记、ISSR标记，以PCR为基础的RAPD标记、AFLP标记和InDel标记，以单核苷酸多态性为基础的SNP标记等。这里简单介绍几种常用的分子标记技术：

1.RFLP标记

限制性片段长度多态性（RFLP）是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变和一段DNA的重新组织等均可导致RFLP的产生。此技术及其从中发展起来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA的提取、限制性内切酶酶切、凝胶电泳分离、DNA片段转移、特定DNA片段显影和结果分析。

2.AFLP标记

扩增片段长度多态性（AFLP）标记技术较其他分子标记有着明显的优越性，应用广泛。其原理是基因组DNA经限制性内切酶充分酶切后，将特定的人工双链接头连在这些片段的两端，形成带接头的特异片段，根据接头序列和酶切位点设计引物，对特异性模板片段进行选择性扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，最后根据凝胶上DNA指纹的特点进行分析。AFLP标记技术的出现，是DNA指纹技术的重大突破，具有多重优点：（1）AFLP分析所需DNA用量少；（2）AFLP技术能够获得更高的信息量；（3）试验重复性好，可信度高；（4）样品适用性广，基因组覆盖面大；（5）AFLP标记表现为典型的孟德尔方式遗传；（6）AFLP可作为物理图谱和遗传图谱的联系桥梁；（7）AFLP分析，不需要预先知道扩增基因组的序列特征等信息。

AFLP标记技术最初用于植物的遗传育种、种质资源鉴定等，现已被大量用于动植物和微生物遗传多样性分析、遗传图谱的构建、医疗诊断、系统发育和分类等研究领域。随着蜜蜂分子生物学研究的不断深入和蜜蜂基因组全序列的测定完成，AFLP分子标记技术也在蜜蜂学研究中初步应用，主要在以下几个方面：（1）种质鉴定和遗传多样性分析；（2）遗传图谱构建；（3）基因定位；（4）标记辅助选择育种；（5）蜜蜂疾病检测等。

3.SSR标记

简单重复序列（SSR）也叫微卫星序列，是由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等建立的一种以简单重复序列为基础的分子标记。基于SSR的分子标记技术具有其自身独特的优点：（1）SSR在生物的基因组中普遍存在，能够对多种基因所表现出的多态性进行分析；（2）多种等位形式一般可共存于一个微卫星位点；（3）SSR标记是共显性的，便于对隐形基因的选择；（4）微卫星标记技术操作简单，重复性好，结果可靠，在DNA量较少的情况下也能完成检测。SSR标记技术的缺点是试验流程复杂，消耗时间。

4.ISSR标记

微卫星（SSR）在真核基因组中无处不在，SSR标记的开发存在一个主要的瓶颈，即侧链序列5′端锚定引物必须是已知的。1994年，Zietkiewicz等基于SSR又开发简单序列间重复序列（ISSR）。ISSR分子标记具有简单，快速，可靠并具有更高水平的DNA多态性的优势，被用作遗传研究的新分子标记（图1）。ISSR分子标记是基于SSR，利用SSR自身来设计引物。ISSR分子标记技术无需序列知识，是以重复序列为基础的引物。在PCR反应中，在SSR的3′端或5′端锚定1～4个核苷酸，使特定位点发生退火反应并对反向排列SSR间的DNA片段进行PCR扩增，之后进行电泳、染色，从而分析不同样品间ISSR标记的多态性。与其他分子标记相比较，ISSR标记具有操作简单、安全性高、成本低、模板DNA的用量少、无需测序和引物设计、多态性丰富、易操作、稳定性强、快捷方便以及适用广泛等诸多优势。ISSR分子标记的不足之处是PCR扩增时的最佳反应条件的摸索过程比较艰难，另外，ISSR分子标记呈孟德尔式遗传（显性遗传标记），并且只是部分共显性，因此不能有效区别检测位点的显性纯合基因型和杂合基因型。

图1 用于ISSR分子标记的荧光定量PCR设备

5.SNP标记

单核苷酸多态性（SNP）是指生物基因组上某个位点存在单个碱基的变化，包括单个碱基对的插入、缺失、转换、颠换等。SNP作为基因组中最广泛、分布频率最高的遗传标记，具有密度高、遗传稳定性高和易于自动化分析等特点。SNP标记检测技术的发展不断地推陈出新，包括以单链构象多态性（SSCP）、酶切扩增多态性序列（CAPS）等基于凝胶电泳技术的传统检测方法，以焦磷酸测序（pyrosequencing）、微测序（SNaPshot）等的直接测序法，以及高分辨率熔解曲线分析技术（HRM）等新兴检测技术。随着新一代DNA测序技术的发展（图2），用于检测SNP的DNA芯片技术也迅速兴起，DNA芯片技术容易实现SNP高通量、自动化检测，已经发展成为非常理想的SNP检测技术。以SNP为基础的分子标记技术被认为是继RFLP、RAPD、SSR之后的新一代分子标记技术，因为其可以检测出基因组DNA上每个碱基对的变化，对生命科学领域起到重要作用，特别是在动物遗传育种领域的作用也日益凸显，应用前景十分广阔。

图2 第三代基因测序设备