地佐辛对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及对Wnt/β-catenin信号通路的影响Δ

宋琳琳，孙 娜，王震生，魏新运

(1.衡水市第二人民医院麻醉科，河北 衡水 053000； 2.衡水市第二人民医院骨科，河北 衡水 053000)

骨质疏松症是一种容易引起脆性骨折和慢性致残性疼痛的疾病，在老年人和绝经后妇女中发生率较高，主要表现为骨量减少和骨骼退化，由破骨细胞和成骨细胞介导的骨吸收与骨形成之间的协调平衡失调引起，研究成骨细胞的增殖、分化对骨质疏松症的治疗具有重要意义[1-2]。地佐辛为强效阿片类镇痛药，在围手术期使用广泛，其在骨折手术中具有良好的镇痛效果[3]。但地佐辛对骨折后愈合及成骨细胞分化是否有影响尚未可知。Wnt/β-catenin信号传导通路参与调控成骨细胞的增殖、分化，在骨形成过程中发挥重要作用，研究结果显示，Wnt/β-catenin信号通路的激活，可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[4-5]。目前，有关地佐辛在成骨细胞MC3T3-E1中的作用研究尚未见报道。因此，本研究探讨了地佐辛对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及对Wnt/β-catenin信号通路的影响，现报告如下。

1 材料

1.1 实验细胞

小鼠成骨细胞MC3T3-E1购自上海拜力生物科技有限公司，批号为BL-1029R。

1.2 仪器

DKW-310型酶标仪、BX51-P型显微镜和ChemiDoc型凝胶成像仪均购自厦门赛多利仪器有限公司。

1.3 药品与试剂

地佐辛注射液(规格为1 mL∶ 5 mg，批号为20210617)购自扬子江药业集团有限公司；DMEM培养基(批号为GUXMD-50029)、矿化诱导培养基(批号为GUXMD-10058)、茜素红染色试剂盒(批号为GUXMD-20154)和RIPA裂解液(批号为GUXMD-29147)均购自赛业(苏州)生物科技有限公司；细胞计数试剂盒-8(CCK-8，批号为JL41527)、Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂(LiCl，批号为JL58179)、碱性磷酸酶(ALP)显色液试剂盒(批号为JL10237)、聚乙二醇辛基苯基醚(批号为JL20875)和ALP检测试剂盒(批号为JL47127)均购自上海江莱生物科技有限公司；兔抗鼠Runt相关转录因子2(RUNX2，批号为ab9012)、骨桥蛋白(OPN，批号为ab6027)、骨钙素(OCN，批号为ab3074)、Wnt3a(批号为ab3098)、β-catenin(批号为ab60121)、β-肌动蛋白(β-actin，批号为ab10563)单克隆抗体和兔抗鼠二抗(批号为ab10028)均购自美国Abcam公司。

2 方法

2.1 CCK-8检测不同浓度地佐辛对MC3T3-E1细胞存活率的影响

将MC3T3-E1细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，细胞融合至约80%时，使用质量浓度为0、5、10、20、40和80 μg/mL的地佐辛处理细胞，在96孔板中培养48 h，每孔加入CCK-8试剂，继续培养1.5 h，检测酶标仪450 nm处的吸光度(OD)值，计算细胞存活率[细胞存活率=各浓度地佐辛组OD值/(0 μg/mL地佐辛组OD值)×100%]，绘制生长曲线，计算细胞对地佐辛的半数抑制浓度(IC50)。每组设6个平行样。

2.2 细胞分组及处理

待MC3T3-E1细胞生长至对数生长期，将MC3T3-E1细胞分为5组，分别为对照组、地佐辛低浓度组、地佐辛中浓度组、地佐辛高浓度组和地佐辛高浓度+LiCl组。其中，对照组正常培养MC3T3-E1细胞；地佐辛低、中及高浓度组分别使用10、20及40 μg/mL的地佐辛处理MC3T3-E1细胞；地佐辛高浓度+LiCl组使用40 μg/mL的地佐辛和20 μmol/L的LiCl[6]处理MC3T3-E1细胞。每组设6个平行样。

2.3 CCK-8检测细胞存活率

将各组处理的MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，培养48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育1.5 h后检测酶标仪450 nm处的OD值，计算细胞存活率(细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%)。

2.4 ALP活性检测

将各组处理的MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，培养7 d后，弃去培养液，以PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定10 min，加入ALP显色液，避光染色20 min，显微镜下观察颜色变化并拍照。另取处理48 h后的各组MC3T3-E1细胞，以PBS洗涤后，使用0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚冰上裂解细胞10 min，将裂解液反复冻融3次，离心收集上清液，按照ALP检测试剂盒操作方法检测ALP活性。

2.5 茜素红染色检测细胞钙化结节

将不同处理组的MC3T3-E1细胞调整成密度为2×105个/mL的细胞悬液，接种于6孔板中，在矿化诱导培养基(含100 nmol/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和7 mol/L地塞米松)中诱导培养21 d，以PBS洗涤细胞，使用95%乙醇固定15 min，再加入0.1%茜素红染色30 min，显微镜下观察并拍照，随机取6个视野观察钙化结节，计算平均值。

2.6 蛋白质印迹法检测细胞中成骨分化相关蛋白(RUNX2、OPN和OCN)及Wnt/β-catenin信号通路蛋白(Wnt3a、β-catenin)表达

不同处理组的MC3T3-E1细胞培养48 h后，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，定量蛋白浓度后，取20 μg蛋白与上样缓冲液煮沸变性后，电泳转膜，分别加入兔抗鼠RUNX2(1∶ 300)、OPN(1∶ 300)、OCN(1∶ 500)、Wnt3a(1∶ 1 000)、β-catenin(1∶ 1 000)和β-actin(1∶ 1 000)单克隆抗体，室温(25 ℃)孵育24 h，再加入二抗(1∶ 3 000)，室温孵育1 h，ECL显色，以β-actin为内参，通过Image软件分析各蛋白相对表达量。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 不同浓度地佐辛对MC3T3-E1细胞存活率的影响

使用质量浓度为0、5、10、20、40和80 μg/mL的地佐辛分别处理MC3T3-E1细胞48 h后，随着地佐辛浓度的增加，MC3T3-E1细胞存活率逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。经计算，细胞的IC50约为20 μg/mL，因此选择10、20和40 μg/mL的浓度作为后续实验的地佐辛低、中和高浓度，见表1。

表1 不同浓度地佐辛对MC3T3-E1细胞存活率的影响Tab 1 Effects of different concentrations of dezocine on the survival rate of MC3T3-E1 cells n=6)

3.2 五组MC3T3-E1细胞存活率比较

与对照组比较，地佐辛低、中及高浓度组细胞存活率依次降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与地佐辛高浓度组比较，地佐辛高浓度+LiCl组细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 五组MC3T3-E1细胞存活率比较Tab 2 Comparison of survival rates among five groups of

3.3 五组MC3T3-E1细胞ALP活性比较

与对照组比较，地佐辛低、中及高浓度组细胞ALP活性依次降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，ALP染色变浅；与地佐辛高浓度组比较，地佐辛高浓度+LiCl组细胞ALP活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)，ALP染色变浅变深，见图1、表3。

A.对照组；B.地佐辛低浓度组；C.地佐辛中浓度组；D.地佐辛高浓度组；E.地佐辛高浓度+LiCl组A. control group; B. dezocine low concentration group; C. dezocine medium concentration group; D. dezocine high concentration group; E. dezocine high concentration+LiCl group

表3 五组MC3T3-E1细胞ALP活性比较Tab 3 Comparison of ALP activity among five groups of

3.4 五组MC3T3-E1细胞钙化结节比较

与对照组比较，地佐辛低、中及高浓度组细胞钙化结节数目依次降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，钙化结节染色变浅；与地佐辛高浓度组比较，地佐辛高浓度+LiCl组细胞钙化结节数目升高，差异有统计学意义(P<0.05)，钙化结节染色变深，见图2、表4。

A.对照组；B.地佐辛低浓度组；C.地佐辛中浓度组；D.地佐辛高浓度组；E.地佐辛高浓度+LiCl组A. control group; B. dezocine low concentration group; C. dezocine medium concentration group; D. dezocine high concentration group; E. dezocine high concentration+LiCl group

表4 五组MC3T3-E1细胞钙化结节数目比较个，n=6)Tab 4 Comparison of the numbers of calcified nodules among five groups of MC3T3-E1 cells n=6)

3.5 五组MC3T3-E1细胞RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平比较

与对照组比较，地佐辛低、中及高浓度组细胞RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平依次降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与地佐辛高浓度组比较，地佐辛高浓度+LiCl组细胞RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3、表5。

表5 五组MC3T3-E1细胞RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平比较Tab 5 Comparison of expression levels of RUNX2, OPN, OCN, Wnt3a and β-catenin protein among five groups of

A.对照组；B.地佐辛低浓度组；C.地佐辛中浓度组；D.地佐辛高浓度组；E.地佐辛高浓度+LiCl组A. control group; B. dezocine low concentration group; C. dezocine medium concentration group; D. dezocine high concentration group; E. dezocine high concentration+LiCl group

4 讨论

地佐辛为新型受体激动-拮抗剂，无明显的呼吸抑制和药物依赖性，具有良好的抗炎、镇痛、镇静和调节免疫作用，在骨折手术中应用广泛[7-9]。有研究结果显示，地佐辛可抑制β淀粉样多肽处理的原代大鼠皮质星形胶质细胞凋亡[10]。本研究使用5～80 μg/mL的地佐辛处理MC3T3-E1细胞48 h后，结果显示，随着地佐辛浓度的升高，MC3T3-E1细胞存活率逐渐降低，表明地佐辛对MC3T3-E1细胞的增殖具有抑制作用。通过计算得出细胞的IC50约为20 μg/mL，因此选择10、20和40 μg/mL作为后续实验浓度。研究结果显示，地佐辛通过靶向调控蛋白激酶B1/糖原合成酶激酶-3β通路调控肝癌细胞的增殖、迁移和有氧糖酵解[11]。本研究使用10、20和40 μg/mL的地佐辛处理MC3T3-E1细胞，培养48 h后，细胞存活率较对照组均降低，且呈浓度依赖性。ALP为成骨细胞分化早期的标志[12]；RUNX2能够诱导成骨细胞的分化[13]；OPN、OCN为成骨细胞活性、组织矿化的重要指标[14]。钙化结节是成骨细胞分化的最后阶段[15]。本研究结果显示，使用10、20和40 μg/mL的地佐辛处理MC3T3-E1细胞后，细胞中ALP活性、钙化结节数目，RUNX2、OPN和OCN蛋白表达水平较对照组降低，呈浓度依赖性，且ALP染色和钙化结节染色变浅。以上结果表明，地佐辛可抑制MC3T3-E1细胞增殖与分化，但其作用机制尚不清楚。

Wnt信号通路在骨相关疾病的发病中有重要作用，Wnt3a可活化β-catenin表达，Wnt/β-catenin信号通路可以通过RUNX2基因促进成骨的形成[16-17]。多项研究结果显示，Wnt/β-catenin信号通路在成骨细胞的增殖及骨形成过程中发挥重要作用[18-19]。研究结果显示，上调Wnt信号转导通路，可促进成骨细胞增殖分化[20]。而抑制Wnt/β-catenin信号通路，则抑制成骨细胞的增殖、分化[19]。本研究结果显示，使用10、20和40 μg/mL的地佐辛处理MC3T3-E1细胞后，细胞中Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平较对照组降低，且呈浓度依赖性，表明地佐辛可能抑制Wnt/β-catenin信号通路。另外，本研究使用Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl与高浓度地佐辛共同处理MC3T3-E1细胞后，细胞存活率、ALP活性和钙化结节数目，RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平较地佐辛高浓度组升高，表明LiCl可逆转地佐辛对MC3T3-E1细胞增殖、分化的抑制作用，证实地佐辛可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，抑制成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化。

综上所述，地佐辛可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制成骨细胞的增殖、分化，但本研究仅通过体外细胞实验对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白进行了初步研究，接下来将结合动物实验做更深入的研究。