重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染的有效性和安全性系统评价

程晓 陈哲 焦雪峰 杨楠,5 刁莎 倪晓凤 刘峥,6 何思颐,5 曾力楠 万朝敏 康德英 吴斌 应斌武 张慧 赵荣生 张伶俐

2021年，我国结核病负担高居全球第二位，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染人数约3.5亿，新发结核病患者84.2万[1-3]。机体感染MTB后是否发病，取决于MTB数量、毒力及机体免疫力。约5%的MTB感染者会在短时间内发展为活动性结核病，约95%的感染者其体内MTB会进入长期潜伏状态，称为结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)[4]。LTBI是新发结核病的巨大源头，特别是在LTBI高危人群中，发病率明显升高。2015年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将开展LTBI系统性筛查和预防性治疗作为2035年终止结核病策略的三大支柱内容[5]。

目前只能通过免疫学方法判断LTBI，即检测机体对MTB感染的特异性免疫应答[1]。结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)是结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)的一种，其原理是基于迟发型变态反应。结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)含有抗原成分200多种，与卡介苗和非结核分枝杆菌有大量相同或相似的抗原成分[6]，是目前临床判断LTBI的常用和传统皮肤试验方法，也是目前唯一纳入我国基本药物目录和医保目录的结核诊断药品[7-8]。

重组结核杆菌融合蛋白(EC)是在国家科技重大专项支持下研发出的用于诊断MTB感染和辅助诊断结核病的新产品，已通过国家药品监督管理局药品审批而准予上市。该产品由高效表达结核分枝杆菌早期分泌靶抗原6(ESAT6)-培养滤液蛋白10(CFP10)基因的大肠杆菌，经发酵、分离和纯化后获得的重组结核杆菌融合蛋白(EC)制成。该蛋白在卡介苗菌株和绝大多数非结核分枝杆菌中缺失，可诱导特异的迟发型变态反应以鉴别MTB感染状态。

重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)均被用于诊断MTB感染和辅助诊断结核病，但目前尚无系统比较两者有效性和安全性的证据。笔者拟采用系统评价方法，评价重组结核杆菌融合蛋白(EC)相较于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)用于诊断MTB感染和辅助诊断结核病的有效性和安全性。

资料和方法

一、文献检索策略

1.检索词：(1)英文检索词：RecombinantMycobacteriumtuberculosisfusion protein、CFP10/ESAT6；(2)中文检索词：重组结核分枝杆菌融合蛋白、重组结核杆菌融合蛋白、宜卡、CFP10/ESAT6。

2.检索数据库：(1)临床指南数据库：国际指南协作网(Guidelines International network，GIN)、英国国家卫生与临床优化研究所数据库(The National Institute for Health and Care Excellence，NICE)、苏格兰校际指南网络(Scottish Intercollegiate Guidelines Network，SIGN)、加拿大医学会临床实践指南文库(Canadian Medical Association Infobase)、澳大利亚指南数据库(Clinical Practice Guidelines Portal)、新西兰指南工作组(New Zealand Guidelines Group，NZGG)、中国指南文库(医脉通临床指南库)和日本医疗信息分布服务协作网(Medical Information Network Distribution Service，MINDS)。(2)生物医学文献数据库：Medline(PubMed)、Cochrane Library、Embase(Ovid)、中国期刊全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)、万方医学网和维普(VIP)数据库。(3)卫生行政部门和行业协会官方网站：中华人民共和国国家卫生健康委员会、中华人民共和国国家药品监督管理局、中国防痨协会、全国团体标准信息平台。(4)不良反应监测官方网站：WHO、中华人民共和国国家药品不良反应监测中心。(5)补充检索：阅读已检索资料的参考文献，补充检索可纳入的文献。检索时间均自建库截止到2022年2月。

二、文献纳入

1.纳入标准：(1)研究对象：年龄、性别和种族不限。(2)干预措施：干预组为重组结核杆菌融合蛋白(EC)，对照组为结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，剂量不限。(3)结局指标：依据NICE的《诊断评估手册》(2011年版)和瑞士南部肿瘤研究所《诊断性试验系统评价指南》(2016年版)，有效性结局指标包括敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、诊断比值比、阳性预测值、阴性预测值和受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)下面积(area under curve，AUC)。安全性结局指标包括上市后安全性及上市前安全性，其中，上市后安全性包括不良反应类型及发生率，上市前安全性包括毒理学、不良事件、不良反应等。(4)研究类型：研究类型不限，包括二次研究(指南、共识、团体标准、系统评价、不良反应监测网报告)和原始研究[随机对照试验(randomised controlled trial，RCT)、队列研究、病例对照研究、病例系列研究、病例报告、横断面调查研究]。

2.排除标准：(1)重复发表的文献；(2)非中、英文文献；(3)原文无法获取的文献。

三、文献筛选与资料提取

由2名研究者独立筛选文献、提取资料并交叉核对。若有争议，通过讨论或由第三人协商解决。资料提取内容包括：(1)纳入研究基本信息：研究作者、发表时间和样本量；(2)研究对象：年龄、性别、疾病状态；(3)干预措施：药品名称、剂型、剂量、给药途径；(4)结局指标；(5)偏倚风险评价相关内容等。

四、偏倚风险评价

采用QUADAS-2工具评价诊断研究的偏倚风险。由2名研究员独立完成，若有争议，由第三人裁定。

五、统计学处理

采用Meta-Disc 1.4软件进行有效性Meta分析，并按照研究对象特征进行亚组分析。采用RevMan 5.3软件进行安全性Meta分析，并按照研究对象特征进行亚组分析。纳入研究结果间的异质性采用χ2检验分析统计学异质性(检验水准为α=0.1)，同时，结合I2定量判断异质性的大小。若各研究结果间存在统计学异质性，则进一步分析异质性来源，在排除明显临床异质性的影响后，采用随机效应模型分析进行Meta分析。对于不能进行Meta分析的数据，采用描述性分析。

结 果

一、有效性结果

(一)文献筛选流程及结果

初检共获得相关文献4821篇，经逐层筛选后，最终纳入研究11篇，包括指南2部、专家共识3篇、团体标准2部、系统评价1篇、RCT 3篇。文献筛选流程及结果见图1。

图1 重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染有效性分析文献筛选流程及结果

(二)基于二次研究证据的系统评价结果

1.指南和专家共识推荐意见：推荐重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)用于诊断MTB感染和辅助诊断结核病的指南2部，专家共识3篇，团体标准2部，见表1。

表1 推荐重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)用于诊断结核分枝杆菌感染和辅助诊断结核病的指南和专家共识

2.系统评价研究结果：纳入系统评价1篇[15]，该研究旨在评价新型结核菌素皮肤试验的有效性，共纳入RCT 22篇，包括俄罗斯研制的Diaskintest相关RCT 15篇、丹麦研制的C-Tb相关RCT 5篇、我国研制的重组结核杆菌融合蛋白(EC)相关RCT 2篇，系统评价结果显示：俄罗斯Diaskintest的敏感度为91.18% (95%CI：81.72%～95.98%)，丹麦C-Tb的敏感度为74.52%(95%CI：70.39%～78.25%)，特异度为97.85% (95%CI：93.96%～99.25%)，我国重组结核杆菌融合蛋白(EC)的敏感度为86.06%(95%CI：82.39%～89.07%)。

(三)基于原始研究证据的系统评价结果

1.纳入研究的基本特征：纳入原始研究3篇，均为RCT，受试者3725例(名)，其中，健康人2392名，患者1333例，纳入临床研究的基本特征见表2。

表2 重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染有效性分析纳入临床研究的基本特征

2.偏倚风险评价结果：诊断性试验的偏倚风险较低，偏倚风险评价结果见表3。

表3 诊断性试验的偏倚风险评价结果

3.有效性评价结果：(1)Meta分析结果显示：不区分人群时，重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的敏感度、阴性似然比差异均无统计学意义，重组结核杆菌融合蛋白(EC)的特异度、诊断比值比、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，差异均有统计学意义。结核病患者与健康人群、肺结核患者与非结核肺部其他疾病患者人群、肺结核患者与健康人群进行亚组分析时，重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的敏感度、阴性似然比差异无统计学意义，重组结核杆菌融合蛋白(EC)的特异度、诊断比值比、阳性预测值优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，差异均有统计学意义。结核病患者与健康人群、肺结核患者与健康人群中，重组结核杆菌融合蛋白(EC)的阳性似然比、阴性预测值优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，差异有统计学意义(表4)。(2)描述性分析结果显示，Ⅱa期临床研究表明，在结核病患者和健康人群，重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的AUC值分别为0.870和0.686(P<0.001)。Ⅲ期临床研究表明，在肺外结核患者人群，重组结核杆菌融合蛋白(EC)的敏感度为0.939，结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的敏感度为0.914，差异无统计学意义；在单纯肺外结核患者人群，重组结核杆菌融合蛋白(EC)的敏感度为0.913，结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的敏感度为0.928，差异无统计学意义；在健康受试者中，重组结核杆菌融合蛋白(EC)、结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)、结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测阴性后接种卡介苗安慰剂人群，重组结核杆菌融合蛋白(EC)的特异度为0.882，结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的特异度为0.609，差异有统计学意义(P<0.01)；在健康受试者中，三种方法[重组结核杆菌融合蛋白(EC)、结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)、T-SPOT.TB]检测阴性后接种卡介苗人群，重组结核杆菌融合蛋白(EC)的特异度为0.927，结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的特异度为0.266，差异有统计学意义(P<0.01)。

二、安全性结果

(一)文献筛选流程及结果

初检共获得相关文献4821篇，经逐层筛选后，最终纳入研究6篇，包括专家共识1篇、RCT 4篇、动物研究1篇。文献筛选流程及结果见图2。

图2 重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染安全性分析文献筛选流程及结果

(二)基于二次研究证据的系统评价结果

1.专家共识推荐意见：纳入专家共识1篇[12]。2020年发布《重组结核杆菌融合蛋白(EC)临床应用专家共识》，指出：Ⅱ期临床试验发现，重组结核杆菌融合蛋白(EC)主要不良反应是局部瘙痒(8.3%，12/144)和疼痛(18.1%，26/144)，无严重不良反应发生。据此得出结论：重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染时受检者耐受性尚可且安全，此基础上，进一步开展了Ⅲ期临床试验。

2.不良反应通报：WHO和中华人民共和国国家药品不良反应监测中心通报未见重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)不良反应相关报道。

(三)基于原始研究证据的系统评价结果

1.纳入研究的基本特征：纳入RCT 4篇，均为随机对照试验，受试者3749例(名)，其中，健康人2416名，患者1333例，临床研究基本特征见表5。纳入动物研究1篇，动物研究基本特征见表6。

表5 重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染安全性分析纳入临床研究基本特征

表6 重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染安全性分析纳入动物研究基本特征

2.不良事件发生率：Ⅰ期临床研究表明，在健康人群，重组结核杆菌融合蛋白(EC)不良事件为红斑1例，不良事件发生率为4.2%(1/24)。Ⅱa期临床研究表明，在健康人群，重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)不良事件均为局部瘙痒和疼痛；局部瘙痒发生率分别为5.4%(3/56)和14.3%(8/56)，疼痛发生率分别为1.8%(1/56)和8.9%(5/56)；在结核病患者人群，重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)不良事件仍均为局部瘙痒和疼痛，局部瘙痒发生率分别为13.0%(7/56)和16.1%(9/56)，疼痛发生率分别为3.6%(2/56)和5.4%(3/56)；重组结核杆菌融合蛋白(EC)不良事件发生率均低于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，但差异无统计学意义。Ⅱb期临床研究表明，重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)均未发生严重不良事件；两者最常见的不良事件是注射部位瘙痒和疼痛，且不良事件多为轻度，在注射后 24 h内出现，持续时间小于48 h。Ⅲ期临床研究表明，重组结核杆菌融合蛋白(EC)安全性良好，皮肤试验后产生的不良事件主要发生在局部，多为注射部位瘙痒和疼痛，多为轻度，未发生严重不良事件。

3.临床前安全性研究：纳入动物研究1篇[19]。关于急性毒性实验，在整个实验过程中，所有实验小鼠未出现任何异常反应和死亡；实验结束后解剖所有小鼠，未发现任何肉眼可见的异常病变。关于豚鼠全身主动过敏实验，各实验组豚鼠在致敏期间均未见明显异常反应。末次致敏后第12天给予激发剂量后，均无过敏反应发生。阳性对照组豚鼠均出现明显的过敏反应症状，甚至死亡。关于兔皮内刺激实验，兔背部分别单次皮内注射0.9%NaCl和重组结核杆菌融合蛋白(EC)后，各观察时间点均未见皮肤红斑及水肿现象。停药72 h后解剖，无红斑、水肿、突起、溃疡等异常。镜下检查，未见充血、水肿、变性和炎性浸润等病理变化。

讨 论

全球近1/3的人口感染MTB，感染人数约20亿，新发结核病患者约990万例，其中约150万例死于结核病[21]。WHO的战略目标是到2035年将结核病发病率降低90%，结核病死亡人数降低95%，要实现这一目标，迫切需要改善结核病的诊断技术。LTBI可进展为结核病，有效识别结核病患者和LTBI者对控制结核病疫情有重要意义[22-23]。

结核菌素皮肤试验操作方便、快速，是一种辅助诊断结核病的常用方法，但其假阳性率较高，易受疾病、药物等的影响。由于其所含抗原与卡介苗和非结核分枝杆菌有众多相似成分，易发生交叉反应，因此，其特异度不高[24]。本研究结果显示，采用重组结核杆菌融合蛋白(EC)诊断MTB感染的敏感度为89.3%，特异度为85.5%；阳性似然比为6.048(>1)，阴性似然比为0.177(<1)，说明重组结核杆菌融合蛋白(EC)诊断出MTB感染的真阳性和真阴性可能性较高；AUC 为 0.870，表明其诊断效能较高[25]。

现有证据表明，重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)安全性类似，均未见严重不良事件。有效性方面，两者敏感度差异无统计学意义，与Krutikov等[15]的研究结果一致。但重组结核杆菌融合蛋白(EC)特异度更高，即其正确地判为无MTB感染的可能性更高。在结核病患者与健康人群、肺结核患者与健康人群，以及不区分人群时，重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的阳性似然比差异有统计学意义，重组结核杆菌融合蛋白(EC)优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，提示重组结核杆菌融合蛋白(EC)阳性时，真阳性的可能性大于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，但重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)阴性似然比差异无统计学意义。重组结核杆菌融合蛋白(EC)与结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)诊断比值比差异有统计学意义，优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)。重组结核杆菌融合蛋白(EC)与结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的AUC值差异有统计学意义，优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，提示其判别准确性优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)。重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)阳性预测值差异有统计学意义，优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，提示其预测MTB感染的能力优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)。重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的阴性预测值差异有统计学意义，优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，提示其预测无MTB感染的能力优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)。

本研究存在的局限性：(1)纳入研究少，且只包含国内研究，缺少其他国家和地区的研究证据；(2)研究人群未涵盖65岁及以上人群。

综上所述，重组结核杆菌融合蛋白(EC)可用于MTB感染诊断、辅助结核病诊断，相较于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，其有效性表现更优，但需继续丰富研究数量，并拓宽研究人群范围。

志谢感谢以下专家组成员对本研究的大力支持：缪丽燕(苏州大学附属第一医院)、王卓(海军军医大学长海医院)、李晓宇(复旦大学附属中山医院)、刘茂柏(福建医科大学附属协和医院)、蔡本志(哈尔滨医科大学附属第二医院)、邱峰(重庆医科大学附属第一医院)、孙峰(北京大学医药管理国际研究中心)、初乃惠(首都医科大学附属北京胸科医院)、林明贵(清华大学附属北京清华长庚医院)、沙巍(同济大学附属上海市肺科医院)

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献程晓和陈哲：直接参与研究方案设计、实施研究和撰写文章；焦雪峰、杨楠、刁莎、倪晓凤、刘峥和何思颐：参与采集数据、分析和解释数据；曾力楠、万朝敏、康德英、吴斌、应斌武、张慧、赵荣生、张伶俐：直接参与研究方案设计、指导研究实施和审阅文章