辽宁省甜樱桃叶枯病病原鉴定*

戴启东，周朝辉，艾佳音，张琪静

（辽宁省果树科学研究所，营口 115009）

甜樱桃是北方地区成熟较早的落叶果树，果实口感丰富，商品价值较高，具有很好的市场前景。随着集约化种植，近年来甜樱桃病害发生呈上升趋势，尤其是叶部病害的发生，可抑制光合作用，造成落叶、落果，影响干物质的积累，严重制约产业的发展。国内外学者对甜樱桃病害进行了一些相关的研究，主要有由黄单孢杆菌（Xanthomonas pruni）引起的叶片穿孔和枝干溃疡病[1]，由疣双胞锈菌（Tranzscheliasp.）引起的樱桃锈病，由土壤农杆菌（Agrobacteriumsp.）引起的根瘤病，由病梨孢（Apiosporinasp.）引起的枝干黑结病，由串珠菌（Moniliniasp.）导致的花芽、小枝及果实腐烂[2]，由外囊菌属（Taphrinasp.）引起的枝疯病，由蜜环菌属（Armillariasp.）和单孢霉属（Phymatotrichumsp.）引起的根腐病[3]等。杨丽萍等[4]、赵远征等[5]通过ITS-rDNA 技术分别对甘肃、辽宁樱桃黑斑病病原进行了研究，认为交链格孢（Alternaria alternata）和细极链格孢（Alternaria tenuissima）是引起该病害的主要致病菌。刘保友等[6]对大樱桃褐斑病菌进行了研究，认为引起褐斑病的病原菌为核果钉孢菌（Passalora circumscissa）。于晓丽等[7]对烟台地区樱桃茎腐病病原菌以及致病性进行了研究，认为烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）是该病的致病菌。关于甜樱桃叶枯病，国内报道相对较少，主要认为由细菌引起，也可由生理胁迫所导致[8]，且病斑后期常伴随有穿孔、脱落。由于甜樱桃叶部病害种类较多，症状相近且不易区分，明确甜樱桃叶部病害的致病菌组成，对合理地制定防治策略极为重要。笔者在辽宁省甜樱桃产区采集到1 种近年来发生较普遍的叶枯类病害样本，通过室内病菌组织分离培养、形态学观察并结合分子鉴定技术，将引起辽宁省甜樱桃叶枯病的致病菌鉴定为层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2021 年，在辽南地区采集到甜樱桃叶枯病的病害样品，主要集中在大连市金州、普兰店地区及营口市熊岳地区，甜樱桃发病较严重的品种主要有美早、砂蜜豆和佳红等。

1.2 试验方法

1.2.1 病菌的分离培养及形态学鉴定

首先将不同地区采集的甜樱桃叶枯病病样于室温条件下保湿24 h，然后在叶片发病部位病健交接处切取4 mm×4 mm 大小的病组织，于0.1%升汞溶液中浸泡30 s，取出后移入70%酒精溶液中浸泡30 s，用蒸馏水冲洗干净后，移入PDA 培养基平板，25 ℃恒温培养，每皿培养3 块发病组织，7 d 后，待长出新鲜菌丝，挑取边缘菌丝再次分离纯化，黑光灯照射，以及光、暗交替（各12 h）刺激菌落产孢后，光学显微镜下于无菌水浮载液观察菌丝、孢子形态进行分类鉴定[9]。

1.2.2 叶片致病性测定

将获得的纯培养菌株进行叶片室内回接试验，采用菌块涂抹法接种[10]，并以无菌水喷施作为对照；回接的寄主品种分别为砂蜜豆、佳红、美早，每个品种接种5 片叶片，每片叶片接种3 个菌块，分别统计接种发病情况。

1.2.3 纯培养菌株的分子鉴定

将具有致病性的菌株平板，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行扩增测序，扩增选用真菌ITS-rDNA 通用引物：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTATTGATATG C-3′）；PCR 产物纯化与测序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司测序部完成。测序结果经Chromas 3.0 软件拼接后，在NCBI-GenBank 进行同源性比对，以确定菌株的同源性，不同菌株亲缘关系发育树采用软件MEGA 7.0 以邻接法构建。

2 结果与分析

2.1 甜樱桃叶枯病菌的分离及致病性测定

从甜樱桃叶枯病病样中共分离得到7 株病菌，其中真菌菌株有3 株，编号分别为LNCY5、LNCY6、LNCY7，细菌菌株有4 株，编号分别为BNCY1、BNCY2、BNCY3 和BNCY4。通过对3 个甜樱桃品种的致病性回接试验发现，只有LNCY7 具有致病性，并且与甜樱桃叶枯病田间发生症状相似，其他6 株菌株均无致病性。致病菌株LNCY7 接种美早、砂蜜豆和佳红的发病率分别为73.3%、46.6%、86.6%。室内接菌5 d 后，在砂蜜豆叶片上产生坏死褐斑，但扩展较慢；在佳红上产生水浸状黑褐色病斑；在美早上病斑扩展较快，有白色菌丝绒毛产生（图版1-A、B、C）。通过不同甜樱桃品种的致病性测定，认为菌株LNCY7 为甜樱桃叶枯病致病菌。

2.2 甜樱桃叶枯病发病症状及病菌种类的形态学鉴定

病害发生初期，叶片正面出现褐色小圆点，大小为1～2 mm；后期病斑圆形至不规则形，直径2～5 mm，且病斑中心有黄褐色晕圈，逐渐扩展至整个叶片，发病后期病斑褪绿，中心有穿孔状，导致叶片干枯死亡（图版1-D）。

该病菌在PDA 培养基上生长较快，气生菌丝初期白色，棉絮状，菌落浓密，不产生分生孢子座；菌落表面初期白色，后期淡驼绒色，分生孢子梗不分枝，产孢方式为单瓶梗型，分生孢子排列成链状或假头状，分生孢子镰刀形，顶胞渐尖，基孢明显，两端略弯曲，分生孢子大多3～5 隔，大小为22.5～55.5 μm×2.5～4.5 μm，通过对其菌落、孢子及产孢表型等形态鉴定（图1），认为该菌为镰刀菌属（Fusariumsp.）真菌[9]。

2.3 菌株ITS-rDNA 分子鉴定及系统发育树的构建

对致病菌株LNCY7 进行DNA 提取，以提取的总DNA 为模板，利用ITS-rDNA 通用引物进行PCR扩增，PCR 产物片段测序后，利用Chromas 3.0 软件拼接，得到大小为566 bp 的特异性片段，通过GenBank-BLAST 分析比对，该菌株与登录号为MH707085.1 的层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）的同源性达到99%。为了进一步明确该菌株的分类地位，选取了与该菌株亲缘关系较相近的镰刀菌菌株，进行了系统发育树的构建，结果表明菌株LNCY7 与层出镰刀菌聚在同一个分支，而与禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、拟轮生镰刀菌（Fusarium verticillioides）等镰刀菌属的近缘种分别聚在不同的分支（图2），结合形态学鉴定和分子鉴定结果，认为该致病菌株LNCY7 为层出镰刀菌，属于子囊菌亚门肉座菌目丛赤壳科镰刀菌属真菌[9]。

图2 基于ITS-rDNA 序列LNCY7 相关菌株的系统发育树

3 讨论与结论

本研究分离得到的甜樱桃叶枯病的致病菌为层出镰刀菌（Fusarium proliferatum），是一类重要的植物病原菌，该病菌寄主范围广泛，在小麦、大豆、香蕉和柑橘上均有报道，不仅可以侵染植物，同时也可侵染动物和人[11-15]。镰刀菌常引起作物苗期根腐病、叶片枯萎病等，但近年来发现该病菌也可侵染果实，对采后贮藏产生影响[16]。镰刀菌属真菌（Fusariumsp.）种类繁多，很多近缘种均有致病性，拟轮生镰刀菌（F.verticillioides）可引起朱蕉叶斑病，层出镰刀菌（F.proliferatum）侵染香蕉果实可引起果斑病[11,16]。通过形态学特征很难快速、准确鉴定这些近缘种，国内外学者不断探索一些具有保守序列的特异基因来区分这些近缘种类，针对钙调蛋白基因设计的特异性引物检测芦笋茎枯病（F.proliferatum），钙调蛋白基因特异性引物可区分处于潜伏侵染阶段的层出镰刀菌（F.proliferatum）和尖孢镰刀菌（F.oxysporum）[17-18]。通过保守的ITS-rDNA 区间设计引物鉴定引起圆葱黑腐病的2种病原菌F.proliferatum和F.verticillioides[19-20]；在该病菌病理生理学方面也取得一定进展：研究人员发现弱酸性条件下香蕉果实更易感染果斑病（F.proliferatum），原因是病菌周围背景环境pH 值发生改变，从而调节了细胞壁降解酶和抗氧化酶的数量来影响病菌的侵染活性[16]；同时层出镰刀菌（F.proliferatum）代谢毒性物质伏马菌素等的致病机理也不断被揭示[21-22]。

本研究认为引起甜樱桃叶枯病的病原菌为层出镰刀菌（F.proliferatum），与已报道的樱桃叶片黑斑病病原链格孢属（Alternariasp.）真菌不同[4-5]，这2 种病害从发病症状上也有明显的区别。通过对不同品种的致病性测定发现，不同品种病斑扩展情况有所不同，该病菌是否存在不同品种抗性差异，有待进一步明确。