重金属铜胁迫苹果砧木根系的显微拉曼光谱诊断研究

李俊猛， 翟雪东， 杨子涵， 赵艳茹, 2, 3， 余克强, 2, 3*

1. 西北农林科技大学机械与电子工程学院， 陕西 杨凌 712100 2. 农业农村部农业物联网重点实验室， 陕西 杨凌 712100 3. 陕西省农业信息感知与智能服务重点实验室， 陕西 杨凌 712100

引 言

重金属污染对生态环境危害已引起广泛关注[1]。 其中， 铜是最常见的重金属污染元素， 也是最容易积累且不易降解的污染元素。 重金属铜元素会破坏农作物的组织结构， 然而其内部结构人眼无法看见， 并且根系是重金属胁迫农作物的直接对象， 易被植物根部吸收。 过量的铜离子一旦进入根细胞， 会改变代谢物水平， 进而影响农作物产量[2]。 因此亟须寻找一种对农作物体内重金属快速、 准确的检测方法， 有利于探明农作物的重金属逆境胁迫响应机制。

重金属物质的传统检测方法主要是借助化学分析法来完成的， 如电化学方法和原子光谱法等[3]， 这些方法虽然检测灵敏度高， 但也存在所用化学试剂易形成二次污染， 难以大批量快速检测等缺点。 拉曼光谱技术通常具有更高的选择性， 提供了更窄的光谱带， 能够提供丰富和高分辨率的化学信息[4]。 目前， 一些学者采用拉曼光谱技术进行农作物中重金属含量的检测。 王海阳等[5]基于拉曼光谱技术评估香根草根内部铅离子的含量， 其检测模型的预测相关系数高于0.85， 其误差小于5.7%， 结果表明拉曼光谱技术可用于测定植物根部重金属的含量。 Tomas等[6]利用拉曼光谱技术比较了四种植物金属硫蛋白亚型， 表达其锌团簇和蛋白质构象的见解， 并做进一步分析得出， 拉曼光谱技术可以分析植物体内的金属盐和络合物。 Barimah等[7]提出一种无标记的氧化亚铜/银(Cu2O/Ag)表面增强拉曼散射(SERS)纳米探针来检测茶中的总砷含量， 开发的Cu2O/Ag耦合化学计量学SERS方法可用于有效地确定、 量化和预测茶叶中的砷含量。 虽然运用拉曼光谱技术监测重金属胁迫下农作物的响应已有一定成果， 但对于重金属胁迫下苹果砧木根系微观诊断尚需要深入研究。

苹果砧木是苹果树生长(或改良)的基础， 对控制树体生长势、 增强苹果树抗逆性及抗病能力、 扩大果树品种适应范围都具有重要意义。 本研究利用拉曼光谱技术进行苹果砧木根系Cu2+的胁迫检测， 可对苹果砧木根系进行精准有效的治理提供方法依据， 进而提高苹果树幼苗的抗逆性以及幼苗存活率， 而且对农作物在重金属污染评价和作物对重金属胁迫的应答机制方面研究有重要指导意义。

1 实验部分

1.1 样本

实验所采用的苹果砧木为“八棱海棠”(Malus×robusta(Carrire) Rehder)。 其具有与果树嫁接亲和力强， 对低平原、 滨海和内陆盐碱地区有较强的适应能力等特性， 是一种优良的苹果砧木， 广泛用于苹果树的嫁接。 八棱海棠播种于2020年11月底， 为防止重金属的污染， 均在不含重金属的有机质土壤中进行育苗。 在土壤中加入重金属难免会由于搅拌不均等因素造成实验误差， 然而水培方法具有浓度均匀， 植物吸收快速， 条件单一等优势。 因此本实验采用水培方法进行试验。 2021年4月30日， 将苹果砧木幼苗在清水里培育2周后进行重金属铜的胁迫实验， 在营养液中分别添加铜离子(Cu2+)含量为0， 6， 12， 18和24 mg·L-1的CuSO4·5H2O溶液， 每个梯度有6株幼苗， 共30株苹果砧木进行本次实验。 2021年5月13日将处理过的苹果砧木置于昼夜温度均为23 ℃、 相对湿度85%的植物培养箱中进行培育7 d， 7 d之后观察各个浓度胁迫下的苹果砧木并无明显差异。

1.2 拉曼光谱数据采集

将不同铜离子浓度胁迫的苹果砧木根系用振动切片机(ZQP-86， 上海之信仪器有限公司， 中国)沿横截面进行切片， 将切好的样本组织置于载玻片上以备拉曼光谱的采集。 拉曼光谱仪使用Thermo ScientificTMDXRTM3xi显微拉曼光谱仪(DXR 3xi， 赛默飞世尔科技， 美国)， 激光器选用波长为532 nm的固体激光器、 显微镜放大倍率10倍， 光谱仪具体参数和拉曼数据采集相关参数如表1所示。 将携有样本的载玻片置于载物台， 聚焦并找到中心位置， 然后完成苹果砧木根系的拉曼光谱数据采集。 对每个样品分别进行光谱测试， 每类样本苹果砧木植株共6株， 每个横截面积采集5条拉曼光谱， 共采集30组拉曼光谱， 5类样本共获得150条拉曼光谱曲线。

表1 苹果砧木根系采集拉曼光谱仪主要参数

1.3 苹果砧木根系拉曼光谱图像采集

通过对苹果砧木根系横截面区域扫描， 进行重金属胁迫后根系横截面组织组成和结构的变化研究。 图1是苹果砧木根系横截面在放大倍率10倍下的白光图， 共扫描1 015个点。 本实验根据特征指纹峰进行苹果砧木根系组织处单波段处的伪彩图成像， 进而研究重金属铜对苹果砧木根系的影响。

图1 苹果砧木根系显微截面图

1.4 苹果砧木根系拉曼光谱数据处理方法

采集苹果砧木根系拉曼光谱数据时会受到外界噪声， 光线以及荧光背景信息的干扰， 影响拉曼光谱质量， 因此在进行拉曼光谱分析时需要对获得的原始拉曼光谱数据进行预处理。 S-G平滑是一种较为简单的数据处理方法， 通过平滑处理能够有效地处理白噪声， 处理在光谱测量中的一些由光学因素产生的影响[8]。 自适应迭代重加权惩罚最小二乘法(adaptive iterative reweighting partial least squares， Air-PLS)是基于PLS方法不断优化的一种数据处理的方法， 自动消除部分无用拉曼光谱峰并保留基线部分， 同时完成基线校正[9]， 用此方法来扣除光谱的荧光等背景信号。

偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis， PLS-DA)是一种被广泛运用的多元数据判别方法[10]， 可以应用于光谱化学分析中的类型判别和模式识别等方面。 PLS-DA计算过程是先对训练集进行建模， 之后对预测数据进行预测， 通过对比实际值与预测值可以得到模型的准确率并能够有效地解决多变量之间相关性的复杂问题[11]。 支持向量机(support vector machine， SVM)是被人们广泛应用的并且具有神经网络所不具有的易收敛、 稳定性较好等优点的一种建模方法。

2 结果与讨论

2.1 苹果砧木根系样本拉曼光谱特征分析

图2 拉曼光谱平均曲线图

图3(a)是浓度为0, 6, 12, 18和24 mg·L-1的CuSO4·5H2O胁迫苹果砧木样品所获取的各个浓度下30组拉曼光谱的平均光谱图。 图3(b)是经过先Air-PLS基线校正处理， 再经过S-G平滑处理后的五种浓度胁迫下样本的平均拉曼光谱图。 图3(b)相较于图3(a)消除光谱的荧光等背景信号， 同时完成基线校正。 从图3中可以看出随着重金属胁迫浓度的升高， 部分拉曼信号强度增加， 但是也有些随胁迫浓度的增加而降低， 这可能是由于植物体内物质受胁迫的特性的关系。

图3 (a)平均拉曼光谱图； (b)预处理后的平均拉曼光谱图

图4表示五种浓度下1 096， 1 329， 1 605和2 937 cm-1波段的拉曼信号强度值。 植物体内重金属亚细胞的分布对重金属的积累， 迁移和解毒至关重要[15-16]。 细胞壁作为阻止重金属Cu进入细胞的第一道屏障， 由纤维素， 半纤维素， 果胶和蛋白质组成， 能够络合重金属， 减少重金属向细胞运输[17]。 其中在重金属铜少量时， 对苹果砧木生长具有促进作用， 过量时对植物产生毒害。 从图4中得出四种波段下随着重金属胁迫浓度的增加拉曼光谱峰强度呈现先增强后减弱的趋势， 结合拉曼指纹峰特性可以得出随着浓度的增加植物体内纤维素、 木质素的含量也随之增加但是当浓度超过18 mg·L-1， 可能此时铜胁迫会对苹果砧木产生毒害作用， 此时纤维素、 木质素的含量也随着降低。 通过扫描重金属胁迫下苹果砧木根系以单波段1 096， 1 329， 1 605和2 937 cm-1拉曼峰成像所得到的伪彩色图像如图5所示， 图中不同的颜色表示拉曼光谱信号的强度。

图4 四种波段下拉曼信号强度图

图5 苹果砧木根系组织处的单波段拉曼峰成像

图5在相同测量条件下， 不同浓度胁迫和不同波段下的拉曼光谱成像可视化图。 对比可以发现相同浓度胁迫不同波数的伪彩图差异不大， 但是不同浓度胁迫下相同波数的伪彩图差异较大。 浓度为0， 6， 12和18 mg·L-1的拉曼光谱成像可视化图基本符合图4中的结果。 然而在24 mg·L-1胁迫浓度下出现异常， 影响拉曼光谱成像的因素有很多， 造成结果可能与在做切片时其根系的粗细不同且我们切片时的横截面厚度较厚和不统一有关， 也可能受到光照的因素影响拉曼光谱技术的成像功能。 可见， 化学成像的可视化表达为拉曼光谱在重金属胁迫检测中提供了新的研究方向。

2.2 苹果砧木根系中Cu2+含量判别模型的建立和对比分析

2.2.1 PLS-DA模型结果与分析

在进行光谱预处理后， 用全部光谱进行建模， 相比与拉曼光谱成像可视化表达， 建立数学模型可将实际问题简单化， 节省判别时间。 对快速检测苹果砧木根系是否受到重金属铜胁迫具有重要意义。 运用样本分类kennard-stone(K-S)算法对150组样本数据挑选进入训练集， 从训练集中挑选100组数据进行PLS-DA建模， 再挑选50组进行预测处理。 运用Matlab R2018b(The Math Works, Natick, MA, USA)平台进行建模分析， PLS-DA模型判别结果如表2所示。 从表2中可以看出， PLS-DA模型准确率为96%(48/50)， 能够较好的判别出苹果砧木是否受到胁迫。

表2 PLS-DA判别结果混淆矩阵

图6 (a)SVM寻优参数； (b)SVM模型

2.2.2 SVM模型结果与分析

使用SVM方法对全部光谱进行建模， 可以得到SVM最佳惩罚系数c=5.278，g=0.003 906 3如图6(a)所示。 首先运用K-means算法对每类样本的30组数据依次进行训练， 随机选取20组进行建模， 剩余的10组进行预测。 建立的SVM模型图如图6(b)所示， 从实际和预测结果来看模型的准确率为100%， 模型效果较好。 这一结果也验证了使用显微拉曼光谱技术检测苹果砧木是否受到重金属胁迫具有可行性。

3 结 论

利用拉曼光谱技术结合化学计量学方法， 对不同浓度重金属铜离子胁迫下苹果砧木根系进行了判别分析研究。 主要有以下结论： (1)通过四个特征峰1 096， 1 329， 1 605和2 937 cm-1进行单波段的拉曼光谱成像， 可得出在同一浓度下拉曼波数与拉曼信号强度成正相关， 而且同一波段下随着胁迫浓度的增加拉曼信号呈先增后减的趋势。 另外， 对图像进行可视化表达之后， 可以清晰地看出不同浓度胁迫拉曼成像有着一定的差距； (2)建立的PLS-DA模型预测准确率为96%， SVM模型预测的准确率达到100%， 因此， 两类模型都具有优越性， 能够较好的预测出苹果砧木根系是否受到胁迫， 为研究重金属胁迫农作物及其产品提供了新的技术思路。 在今后的研究中， 需要进行根系中重金属铜含量的定量检测， 进一步扩大样本范围和重金属浓度梯度以确定该模型的稳定性和适用性。