PCR检验的质量控制

◎ 徐 枫，艾 萍，金 浩，刘 卓，陈振宇，赵 咏

（1.锦州市疾病预防控制中心，辽宁 锦州 121000；2.锦州市第二医院，辽宁 锦州 121000；3.锦州市妇婴医院，辽宁 锦州 121000；4.锦州医科大学，辽宁 锦州 121000）

食品的安全问题一直是社会关心的热点，它直接关系到公众的身体健康以及生命安全，并对国民经济的发展以及社会的稳定产生影响。PCR技术以其高特异性、高灵敏性和简便快捷的特点，为食品安全与质量安全问题提供科学依据。但PCR要求比较严格，容易造成实验污染和操作污染引起的假阳性结果。如果扩增仪温度不准确、反应液处理不好，会导致PCR抑制物进入反应体系且出现假阴性结果。为保证PCR检验结果的准确性，做好PCR的质量控制至关重要。影响PCR检验质量的因素很多，总体上涉及以下几个方面。

1 实验室设置设施

PCR反应是一种广泛用于使特定DNA或RNA样本快速生成数百万至数十亿个拷贝的方法。在扩增过程中，会产生大量的扩增产物，如果控制不好极易造成实验室污染。为防止这种污染的发生，需要对实验室进行合理分区。标准的PCR实验室分为相互独立的4个区域，涵括试剂准备区、样品制备区、扩增区以及产物分析区[1]。各工作区域有明确的标识，各区的实验物品不得混用，应贴上不同颜色标识予以区别。进入各工作区域必须严格按照试剂准备区、样品制备区、扩增区、产物分析区方向依次进行，避免造成 交叉污染。

2 人员管理

实验人员要具有相关的专业知识及2年以上的检验工作经历，具备熟练的技术操作和正确分析判断实验结果的能力。应定期对实验人员进行专业知识和安全知识的培训，做好人员的能力评估。

3 性能验证

开展新的检验前，对提取和扩增设备、提取和扩增试剂在内的全套实验室检验系统进行全面的性能验证。增加新的检验设备、更换提取和扩增试剂厂家、仪器设备进行大维修及更换关键部件等可能会影响到性能时也需要进行验证，验证一般包括以下几种方法。

（1）方法符合率。选取阴性样本5例，阳性样本10例，按照样本检验程序，所得结果与预期结果相比较，计算符合率（表1）。阴性样本及阳性样本的符合率应达到100%。

（2）检出限。使用定值标准物质，稀释至厂家声明的检出限浓度，重复测定5次，必须100%检出靶核酸。或在不同批次内对该浓度样本进行20次重复测定，必须检出至少18次靶核酸。

（3）抗干扰能力。在弱阳性样本（弱阳性质控品）中加入干扰物质（如血红蛋白、甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白G、类风湿因子和药物等）溶液，使得干扰物质的终浓度与厂家声明的浓度相同[2]。与常规样本一样处理，对照组加入等量的溶剂，至少重复测定3次以上，弱阳性样本检验仍为弱阳性结果，则验证通过。通过表2的实验结果可以得出SARS-CoV-2 RNA对血红蛋白、白蛋白、利巴韦林+阿奇霉素具有抗干扰能力。

表2 抗干扰能力实验结果表

（4）交叉反应。应验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测的影响。主要指与检测对象核酸序列具有同源性，易引起相同或相似临床症状的病原体核酸。例如，取含冠状病毒假病毒阳性样本的分析特异性参考品（如国际参考品、国家参考品、厂家参考品）与常规阴性样本一样处理，至少重复检验3次结果都为阴性，则交叉反应验证合格。交叉反应实验结果见表3。

表3 交叉反应实验结果表

（5）正确度。参加国家组织的实验室间质量评价或与同级别或高级别的机构进行实验室间比对，至少包括异常值和正常值的5份样品，以≥80%的结果在规定范围内为正确度验证通过。

（6）重复性。选择至少两个水平稳定的评价样本，同一批次内对样本进行20次重复测定。实验过程中应至少检验一个质控品。依据两组实验数据（水平1、2），分别计算结果的均值、标准差和变异系数。以能力验证/室间质评评价界限（靶值±lg0.4）作为允许总误差（TEa），要求重复性精密度＜3/5 TEa（0.24），中间精密度＜4/5 TEa（0.32）[3]。

4 仪器设备

实验室必须有质量可靠的仪器设备，以保证检验质量。温度偏离程序设定的目标值对PCR扩增效果有一定影响，对于低含量的模板样品，温度偏差可能导致阴阳性的结果改变。因此，实验室应该固定日期对PCR仪的反应孔进行温度校准以及期间核查，还需要对PCR检验相关的仪器设备进行检定校准，保证所出数据的准确，同时规范仪器设备的使用和维护[4]。

5 试剂和关键耗材

试剂应有专人保管，在有效期内使用，按照其规定的保存要求存放。试剂批间比对，一般选取5个旧批次试剂检验过的样品，覆盖测量区间（包括阴性、临界值、低值、中值和高值），用新批次试剂进行检验。对两批次检验结果进行偏差计算分析，至少有4个样品结果偏差小于±7.5%，且阴性和临界值样本符合预期，则提示两批次试剂批间差异符合要求[5]。

耗材的质量也会影响PCR的检验结果，关键耗材应不含抑制物，必须使用带滤芯的吸头，但不能使用玻璃离心管，避免造成泄露。样品采集管和PCR反应管管帽应密闭完好，防止产生气溶胶。

6 对标本的要求

标本的采集时间、采样量和采样容器严格按照标准要求执行。采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检验过程造成干扰。所有标本采集后，应尽快送往实验室，标本在室温（25 ℃）放置不宜超过4 h。如果需要长途运输，采用干冰等制冷方式进行保藏，标本运送期间避免反复冻融。

7 实验室间质量评价

实验室要经常参加实验室间比对和能力验证，通过实验室间比对和能力验证评价参加者的能力，监测检验结果的准确性，提高实验室的检验能力。

8 结语

PCR检验的质量控制是实验室的核心活动，要做好质量控制，最重要的是要了解影响检验质量的所有因素，控制好这些影响因素，对出具准确的检验结果可以起到至关重要的作用。