参与DMSP/DMS循环的极地细菌初步筛选及其多样性研究❋

高雪雨， 商 丽， 吴蕾蕾， 张晓华,2,3， 史晓翀,2,3❋❋

(1. 中国海洋大学海洋生命学院， 山东 青岛 266003；2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室， 山东 青岛 266237；3. 中国海洋大学深海圈层与地球系统前沿科学中心， 山东 青岛 266100)

极地通常指包括南极(>60°S)、北极(>60°N)在内的高纬度、高海拔地区，南极以冰封大陆生境为主，长年为冰雪覆盖，仅有少数地区存在人类活动[1]，北极以低温海洋生境为主，水文条件复杂多样，且受人类活动影响较大[2]。极地具有气温较低、营养物质贫乏、夏季强辐射、极昼极夜交替等特殊的环境特征[3]，给生物进化带来了选择压力，造就了极地微生物适应极地生态环境的独特性，这些微生物也演化出了特殊结构和功能，能够通过多种代谢途径，参与极地关键生源要素循环的过程，如氮循环[4]和硫循环[5]等。在硫循环过程中，微生物参与的以二甲基巯基丙酸内盐(Dimethyl sulfoxide，DMSP)和二甲基硫(Dimethyl sulfide，DMS)为主要介质的海-气界面硫循环也得到了较多关注[6-7]，但相对于中低纬度海区，对参与DMSP/DMS循环的极地细菌的研究仍相对较少。

DMSP是一种重要的含硫化合物，以溶解状态广泛存在于海洋环境中，储量丰富，有研究估计海洋DMSP的年产量约2.0×1015g[8]。在营养贫乏的海洋环境中，DMSP作为碳源和硫源为微生物所利用，弧菌还可以利用DMSP做渗透压保护剂[9]。DMSP可经多种途径产生具有挥发性的DMS，DMS又可经氧化还原反应与DMSO相互转化，这2种气体都是硫元素从海洋释放到大气后的产物[10]。DMS和DMSO都可以促进云的形成，一方面可以减少太阳辐射，另一方面可以带来更多降水，减缓地球的温室效应，因此被称为“冷室气体”[11]。以往认为DMSP主要由单细胞微藻、大型海藻、盐生植物及珊瑚等真核生物合成[12-15]，但目前也发现α-变形菌纲细菌如玫瑰杆菌等也可以合成DMSP[16]，但相对真核生物，对DMSP合成细菌的研究还较少。DSMP在自然条件下降解速度缓慢，其主要的分解者是真核微生物和原核微生物中的异养细菌[17]。极地具有丰富的DMSP储备，有研究估计南大洋和南极大陆的DMS产量占全球年产量的10%[18]，因此极地被认为是全球产硫的重要区域[19]。除了作为细胞的渗透压保护剂，DMSP还是一种重要的冷冻保护剂，细菌可利用DMSP减少冷冻对细胞的损伤[20]，而极地特殊的环境条件可能对细菌的DMSP合成和降解途径中的诸多环节产生影响，使之与其他海区的DMSP相关功能细菌存在差异，研究极地具有DMSP合成和降解能力的细菌对了解极地DMSP循环过程具有重要意义。

本文利用实验室建立的极地微生物资源库，针对其DMSP合成和降解能力进行筛选，并进一步比较分析参与DMSP/DMS循环的极地细菌的物种多样性，为研究和评估极地微生物参与全球DMSP/DMS循环的作用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 菌株样品

菌株来自本实验室建立的极地微生物资源库，分离自多次南北极考察获得的海水和沉积物样品[21-22]。依据现有菌株的分离来源和分类地位等，从中选择了174株细菌(共61属、100个种)进行DMSP合成和降解活性的初步筛选，其中61种、112株细菌分离自北极北欧海海水，43种、62株细菌分离自南极菲尔德斯半岛海水和沉积物。

1.2 培养基

本研究采用3种不同的培养基，都以海洋异养细菌的常规培养基2216E为基础[23]。添加丙酮酸钠，配制2216E固体平板作为活化培养基。以液体2216E培养基为母液，添加100 mmol/L DMSP溶液(终浓度1 mmol/L)，配制DMSP降解细菌的初筛培养基；添加100 mmol/L甲硫氨酸溶液(终浓度5 mmol/L)，配制DMSP合成细菌的初筛培养基。

1.3 具有DMSP降解能力极地菌株的初步筛选

菌株连续活化2～3次后，使用DMSP降解菌初筛培养基进行初筛，阳性对照菌株为LabrenziaaggregateLZB033，该菌可通过降解DMSP产生DMS[16]，阴性对照为不具备DMSP降解活性的菌株PelagibacabermudensisLZD001[24]，每组样品各设置3个平行。

1.4 具有DMSP合成能力极地菌株的初步筛选

菌株连续活化2～3次后，使用DMSP合成菌初筛培养基进行初步筛选，阳性对照菌株同样为LabrenziaaggregateLZB033，该菌也可利用甲硫氨酸(Met)为底物合成DMSP[16]，阴性对照为PelagibacabermudensisLZD001，每组样品各设置3个平行。

1.5 物种多样性分析

统计、分析数据采用SPSS version 25(https://www.ibm.com/cn-zh/analytics/spss-statistics-software)。使用Origin version 2018(https://www.originlab.com/)对不同分类水平的物种组成进行可视化，制作物种组成Venn图采用网站Jvenn(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)的算法[25]。

2 结果与分析

2.1 潜在DMSP降解细菌初步筛选及其降解能力评价

具有DMSP降解潜能的细菌可以利用DMSP底物，使其裂解产生DMS或脱甲基产生MeSH，使用气相色谱仪检测DMSP降解生成的气体，记录实验组检测样的峰值，以空白对照和阴性对照LZD001菌株的检测值为基线，以阳性对照LZB033菌株的检测值为参考标准。

如表1所示，在174株极地细菌中，初步筛选出103株(59.2%)具有DMSP降解活性的菌株，其中的93株(93.2%)细菌能够通过脱甲基途径降解DMSP，52株(50.5%)细菌能够裂解DMSP释放DMS，45株(43.7%)细菌兼有脱甲基和裂解2种途径，表明在可培养细菌代谢DMSP的过程中，脱甲基途径比裂解途径更常见。另一方面，在全部174株极地细菌中，脱甲基产生MeSH活性较强及以上的极地细菌共73株(42.0%)，经裂解途径产DMS的降解活性较强及以上的极地细菌共16株(9.2%)，表明接近一半细菌具有较强的脱甲基降解活性，而具有裂解途径的降解细菌较少，多数菌株裂解活性较弱。

表1 初步筛选潜在DMSP降解菌及其降解活性评价表

续表1

2.2 潜在DMSP合成细菌初步筛选及其合成能力评价

具有DMSP合成潜能的细菌可以利用Met底物合成DMSP，通过气相色谱仪检测DMSP碱解产生的DMS气体，记录实验组检测样的峰值，以空白对照和阴性对照LZD001菌株的检测值为基线，以阳性对照LZB033菌株的检测值为参考标准。

如表2所示，在174株极地细菌中，初步筛选出28株(16.1%)能够通过Met底物合成DMSP的极地菌株，其中只有9株细菌具有强或较强的DMSP合成活性，在总体中占比约5%，表明极地可培养细菌中具有DMSP合成活性的菌株较少。

表2 初步筛选潜在DMSP合成菌及其合成活性评价

2.3 参与DMSP/DMS循环的极地细菌物种多样性

分离自极地环境的174株细菌分属于4门(变形菌门94株、拟杆菌门31株、放线菌门29株、厚壁菌门20株)、7纲(γ-变形菌纲65株、α-变形菌纲27株、β-变形菌纲2株、放线菌纲29株、黄杆菌纲29株、芽孢杆菌纲20株、纤维粘网菌纲2株)、62属、110种。

初步筛选获得DMSP降解细菌共103株，分属于4门(变形菌门61株、放线菌门20株、厚壁菌门15株、拟杆菌门7株)、6纲(γ-变形菌纲46株、α-变形菌纲14株、β-变形菌纲1株、放线菌纲20株、芽孢杆菌纲15株、黄杆菌纲7株)、42属、76种(见图1A)，其中厚壁菌门、放线菌门和变形菌门的潜在DMSP降解细菌占比在50%～75%之间，拟杆菌门占比略高于20%，显著少于其他类群。初步筛选获得DMSP合成细菌共28株分属于4门(变形菌门21株、拟杆菌门3株、放线菌门2株、厚壁菌门2株)、6纲(γ-变形菌纲14株、α-变形菌纲5株、β-变形菌纲2株、黄杆菌纲3株、放线菌纲2株、芽孢杆菌纲2株)、19属、25种(见图1A)。在纲水平上，具有降解活性的菌株中大多属于γ-变形菌纲、放线菌纲、芽孢杆菌纲、放线菌纲，具有DMSP合成活性的菌株主要属于γ-变形菌纲、α-变形菌纲和黄杆菌纲。在属水平上，DMSP降解菌中丰度高的前6个属为：嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、副球菌属(Paracoccus)、动性球菌属(Planococcus)、噬脯氨酸菌属(Prolinoborus)、盐水杆菌属(Salinibacterium)，DMSP合成菌中丰度高的前5个属为：假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、海杆菌属、黄杆菌属(Flavobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)(见图1B)。

(A：门水平Phylum level；B：属水平Genus level。DMSP降解菌：具有经脱甲基途径或裂解途径降解DMSP能力的极地菌株；DMSP合成菌：具有经Met底物合成DMSP能力的极地菌株。DMSP degrading bacteria: polar strains with the ability to degrade DMSP through demethylation or lysis pathways; DMSP synthesizing bacteria: polar strains with the ability to synthesize DMSP via Met substrates.)

综合比较参与DMSP/DMS循环的极地细菌，在降解途径方面，通过脱甲基途径降解DMSP的细菌96株，分属于4门、6纲、38属、71种，通过裂解途径降解DMSP的细菌52株分属于4门、6纲、29属、42种。其中有37种(45株)细菌兼有2种降解途径，34种(51株)细菌只有脱甲基途径，5种(7株)细菌只有DMSP裂解途径(见图2A)，其中Aeromicrobiumginsengisoli和Kocuriarosea属于放线菌纲，Lelliottiaamnigena和Stenotrophomonasrhizophila属于γ-变形菌纲。能够通过脱甲基和裂解途径降解DMSP并能够从Met合成DMSP的极地细菌共14种、17株(见图2A)，其中12株属于γ-变形菌纲，表明同时具有DMSP合成和降解能力的细菌在γ-变形菌纲中分布较为广泛。而变形菌门(占比>60%)和所属的γ-变形菌纲(占比>40%)是参与DMSP/DMS循环的优势类群(见图2B、C)。

(A：不同代谢途径细菌类群Bacterial groups with different metabolic pathways；B：门水平Phylum level；C：纲水平Class level。DMSP脱甲基：经脱甲基途径降解DMSP；DMSP裂解：DMSP的裂解途径；DMSP合成：DMSP的合成途径。DMSP demethylation: Degradation of DMSP through demethylation pathway; DMSP cleavage: Cleavage pathway of DMSP; DMSP Synthesis: synthesis pathway of DMSP.)

2.4 具有DMSP代谢活性极地细菌多样性

174株极地细菌分别分离自北欧海表层海水样品(112株)和南极菲尔德斯半岛潮间带沉积物和海水样品(62株)。在纲和属的分类水平上，分离自北极的DMSP降解菌包括γ-变形菌纲的莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、假单胞菌属(Pseudomonas)和海杆菌属(Marinobacter)、α-变形菌纲的副球菌属(Paracoccus)和亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacter)、放线菌纲的盐水杆菌属(Salinibacterium)、芽孢杆菌纲的大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)等占优势；分离自南极的DMSP降解菌中，γ-变形菌纲的嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、放线菌纲的盐水杆菌属(Salinibacterium)、黄杆菌纲的黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌纲的动性球菌属(Planococcus)等占主导地位(见图3A)。北极来源的DMSP合成菌以γ-变形菌纲的假单胞菌属(Pseudomonas)和海杆菌属(Marinobacter)、α-变形菌纲的亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacter)为主；南极来源的DMSP合成细菌以γ-变形菌纲的嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和黄杆菌纲的黄杆菌属(Flavobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)为主(见图3B)。可以发现，γ-变形菌纲细菌在南北极都广泛参与DMSP/DMS循环，α-变形菌纲类群中的功能细菌在北极较为活跃，黄杆菌纲细菌在南极可培养细菌中占据优势，且该类群中的某些细菌兼有DMSP降解和合成活性。可以看出，极地环境中，具有DMSP合成活性的细菌类群少于DMSP降解细菌的类群，而南极来源的功能细菌类群少于北极来源的细菌群落。

(A：纲水平Class level；B：属水平Genus level。北极降解菌：北极来源的DMSP降解菌，南极降解菌：南极来源的DMSP降解菌；北极合成菌：北极来源的DMSP合成菌；南极合成菌：南极来源的DMSP合成菌。Degrading bacteria from Arctic: DMSP degrading bacteria from the North Polar, Degrading bacteria form Antarctic: DMSP degrading bacteria from from the South Polar; Synthetic bacteria from Arctic: DMSP synthesizing bacteria from the North Polar; Synthetic bacteria form Antarctic: DMSP synthesizing bacteria from the South Polar.)

3 讨论

以DMSP/DMS为载体的海-气界面硫循环是生源物质的生物地球化学循环中的关键环节和重要组成部分，同时也对全球气候变化具有重要影响，因此研究海洋生境中介导该循环的细菌类群成为一个热点[26]，但目前为止，诸多研究报道中参与DMSP/DMS循环的海洋细菌群落大多分离自温带、亚热带海域，较少关注极地环境中的细菌群落及其在硫循环方面的贡献[27]。本研究通过对分离自北欧海表层海水样品和南极菲尔德斯半岛潮间带沉积物样品的174株细菌进行初步筛选，发现了一些能够参与DMSP/DMS循环的极地细菌类群，并初步阐明了其细菌群落结构和分布情况。

本研究以极地来源的100种、174株待测菌株为实验对象，经过初步筛选，发现其中约59.2%的细菌具有不同程度的DMSP降解能力，说明能够降解DMSP的细菌在极地广泛存在，Howard等[28]研究发现海洋表层水体中能够通过脱甲基途径降解DMSP的细菌占细菌总数的一半以上，与本研究结果相近。研究还发现在可培养的DMSP降解菌中，约93.2%(96株细菌)能够通过脱甲基途径降解DMSP，分属于4门、6纲、38属、71种，通过裂解途径降解DMSP的细菌占比约50.5%，52株细菌分属于4门、6纲、29属、42种，绝大多数降解菌采用脱甲基途径，而拥有裂解途径的细菌相对较少且物种多样性较低，此外，可降解细菌中，43.7%的菌株兼有脱甲基和裂解2种途径，表明在营养匮乏的极地海洋或沉积物中，大多数细菌倾向于利用DMSP作为碳源或硫源生长，而这一生理过程需要脱甲基途径产生的MeSH和乙醛，这与Kiene[29]等研究中报道的50%～90%的DMSP都会通过脱甲基途径为浮游细菌所降解的结论相一致。对极地DMSP降解菌的物种多样性研究发现，厚壁菌门、放线菌门、变形菌门的潜在DMSP降解细菌占比在50%～75%之间，主要分布在γ-变形菌纲、α-变形菌纲和放线菌纲中，拟杆菌门黄杆菌纲具有DMSP降解能力的细菌低于其他类群。Curson等通过对具有DMSP降解活性的海洋细菌的研究指出裂解途径主要由Ddd裂解酶来完成，这些酶主要存在于变形菌门的γ-变形菌纲[30]和α-变形菌纲中[31]，与本研究的结果一致。此外还发现具有DMSP降解活性的细菌类群在纲水平上的分布情况与本研究获得的DMSP降解菌株类群多样性接近，说明具有DMSP降解能力的细菌(经脱甲基和裂解途径)在极地环境中分布广泛。

本研究中共获得具有DMSP合成能力的菌株28株(16.1%)，且大多数合成能力较弱。能够利用Met底物合成DMSP的极地细菌类群主要包括γ-变形菌纲的假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和海杆菌属(Marinobacter)等以及黄杆菌纲的黄杆菌属(Flavobacterium)等，该结果与张晓华[32]等根据目前已有的报道认为能够合成DMSP的细菌多来自α-变形菌纲中的海洋玫瑰杆菌的结论不一致，但吴蕾蕾[22]在南极非培养细菌多样性研究中发现，γ-变形菌纲和黄杆菌纲等为优势类群，商丽[21]在北欧海可培养细菌多样性研究中也发现，γ-变形菌纲的假单胞菌属处于优势地位，已有研究表明，DMSP可以发挥细菌抗冻剂的作用[33]，可能作为极地细菌的一种环境适应策略，使具有DMSP合成能力的极地细菌获得生长优势，因此本研究发现功能细菌类群(如嗜冷杆菌属[34]和黄杆菌属[35])，之所以在极地可培养细菌中具有较高丰度，可能也与其为适应寒冷环境而逐渐演化出合成DMSP的相关基因有关。另一方面，28株DMSP合成菌中，14种、17株细菌兼有降解DMSP的脱甲基和裂解途径，其中12株属于γ-变形菌纲，表现出与阳性对照LabrenziaaggregataLZB033相似的活性，猜测这些菌株可能合成DMSP以提升抗逆能力，同时也利用环境中的DMSP作为营养物质。本研究还发现2株DMSP合成能力较强的菌株，成都假单胞菌(Pseudomonaschengduensis)和栖藻黄杆菌(Flavobacteriumalgicola)，分别属于γ-变形菌纲和黄杆菌纲，未见与其DMSP合成能力相关的报道，有待进一步研究。

从极地细菌的来源看，63.4%的北极可培养细菌(33属、50种、71株)能够不同程度地降解DMSP，51.6%的南极可培养细菌(14属、27种、32株)具有DMSP降解活性，北极来源细菌中DMSP降解细菌占比较高，在可培养细菌中分布较广。北极来源的DMSP合成细菌(15属、18种、20株)菌株数占比约17.9%，南极来源的DMSP合成细菌(4属、7种、8株)占比约12.9%，仍以北极来源的DMSP合成菌较高，特别是，28株潜在DMSP合成细菌中有9株菌合成能力较强，其中8株分离自北欧海水体样品。结果表明，DMSP降解菌和合成菌中，北极来源的细菌占比较高，且生物多样性更高。这可能与菲尔德斯半岛与北欧海地理条件的差异有关[36]，也可能是表层水体中的浮游细菌和沉积物中细菌类群存在差异，但本研究还发现南北极可培养细菌的群落结构比较相近，因此推测相较于6 ℃以上的南极沉积物环境[37]，北极表层水体中的可培养浮游细菌在较冷的环境中更可能利用DMSP作为细胞抗冻剂，使得其在北极海水中能够参与DMSP/DMS循环的细菌类群更多样且活跃。在DMSP降解菌和合成菌的类群分布上，研究发现γ-变形菌纲细菌在南、北极广泛参与DMSP/DMS循环，α-变形菌纲类群中的功能细菌在北极较为活跃，黄杆菌纲为南极来源功能细菌的特征菌群，且该类群细菌兼有DMSP降解和合成活性。在本研究的菌株样品中，不同分离来源的功能细菌群落在属水平上存在较大差异，比如南北极来源的降解菌都主要分布于γ-变形菌纲，但北极来源的降解菌主要包括莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、假单胞菌属(Pseudomonas)等，南极来源的降解菌主要包括嗜冷杆菌属(Psychrobacter)，这意味着对不同极地来源的DMSP相关功能细菌可能需要分别进行研究。

研究北极和南极环境中参与DMSP/DMS循环的细菌类群，一方面能够加深对极地细菌生态功能的认识，并对细菌群落的演化及其与环境的互作过程获得更多的了解，另一方面也能利用新发现的极地DMSP相关功能细菌对细菌介导的DMSP合成和代谢进行进一步的研究。本研究通过对不同来源的极地DMSP合成/降解菌株进行初步筛选和比较，发现了一些具有潜在研究价值的功能性细菌类群，并且发现DMSP/DMS相关细菌在极地广泛分布，为深入研究参与全球DMSP/DMS循环的极地微生物提供了基础资料。