设施土壤灭菌与摩西球囊霉对黄瓜幼苗生长及养分吸收的影响

2022-09-05樊娅萍宋柏权陈芳玲贺苗苗王倡宪

南方农业学报 2022年6期

樊娅萍，宋柏权，陈芳玲，贺苗苗，王倡宪

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，黑龙江哈尔滨 150080）

0 引言

【研究意义】设施蔬菜是我国农业生产的重要组成部分，据统计，截止2020年，我国的蔬菜种植面积达2148.5万ha，且呈现逐年增加的趋势。黄瓜作为我国设施的主要栽培蔬菜种类之一，连作现象十分普遍，黄瓜连作后生长受抑，长势不良，土传病害频发，为解决设施黄瓜连作障碍问题，轮作、嫁接、土壤消毒等多项措施便应运而生（朱维伟，2020），其中，土壤消毒技术因其经济、高效、便捷而在生产实践中广泛应用。土壤消毒诸多技术各有利弊，相较于化学消毒，物理消毒尤其是高温蒸汽消毒因其环保、不产生病原的抗性等显著优点而成为一种良好的化学消毒替代技术（曹坳程等，2010）。丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌广泛分布于各类生态系统中，其为专性活体营养共生真菌，能侵染90%的陆生维管植物根系，形成具有双膜结构的菌根共生体（Redecker et al.，2000；Smith and Read，2008）。共生关系建成后，互惠型AM真菌能有效改善土壤微环境，并通过菌根方式促进各种矿质养分和水分的吸收，提高作物产量与品质（王秀芹和张福墁，2001；舒波等，2016；Luginbueh et al.，2017）。因此，明确AM真菌与连作土壤灭菌处理对黄瓜幼苗生长及养分吸收的影响，可为缓解设施黄瓜连作障碍提供必要的理论依据，对设施黄瓜生产意义重大。【前人研究进展】土壤灭菌处理能改良土壤理化性质，调节土壤pH、Eh和EC值，抑制甚至杀死土传病原菌，从而有效降低植物发病率（周开胜，2015）。也有研究发现，高温蒸汽消毒可提高沉积物可溶有机碳和活性磷含量（Covacevich et al.，2014；Hu et al.，2020）；对再植10年的桃树土壤121 ℃湿热灭菌45 min后发现，土壤速效磷含量在一定程度上有所提高（Li et al.，2019）。此外，土壤消毒处理对植物吸收养分及生长具有显著促进作用（Biró et al.，2000）。高温蒸汽消毒技术对病原的消杀作用毋庸置疑，但消毒后土壤微生物数量锐减，而土壤养分的有效化与土壤微生物的活动密不可分。因此，适时引入有益微生物以创造健康的微生态环境是关键。AM真菌可侵染黄瓜根系形成菌根（Kubota et al.，2005；Wang et al.，2008），适宜的共生体组合对黄瓜抗病能力的增强（王倡宪等，2012；Wang et al.，2012；王维华等，2017；Ravnskov et al.，2020），抗寒性和耐盐性的提高（庄福金等，2017；Sallaku et al.，2019），以及连作障碍的缓解（唐艳领等，2018）具有积极作用。AM真菌对宿主植物的有效侵染是菌根作用发挥的关键，而介质中磷水平是决定侵染率的主要因素。通常，介质中低磷水平更有利于AM真菌侵染和菌根效应的发挥，反之，高磷水平则会表现不同程度的抑制作用（Smith and Read，2008）。AM真菌共包含1纲4目11科27属约300种，其中，摩西球囊霉（）为球囊属真菌，该真菌广泛分布于农业生态系统，能与各种农作物形成互惠体，并在农作物的生长发育及抗逆方面显示出了诸多有益作用（Naher et al.，2013；王幼珊和刘润进，2017）。【本研究切入点】黄瓜作为菌根化连作植物，其与AM真菌的共生效应已有研究，而黄瓜育苗生产中，对连作土壤进行高温灭菌并结合AM真菌接种技术的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】对设施黄瓜连作土壤进行高温灭菌处理，并于黄瓜育苗时接种摩西球囊霉（），探讨摩西球囊霉与土壤灭菌处理对黄瓜幼苗生长及氮磷钾养分吸收的影响，明确连作土壤灭菌条件下摩西球囊霉与黄瓜的共生效应及相关机制，以期为设施黄瓜生产中连作障碍的缓解探索一条经济有效的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄瓜品种为津春3号，由天津科润黄瓜研究所提供。播种前温汤浸种，先置于50～55 ℃蒸馏水中持续搅拌15 min，然后在10% HO中浸泡5 min表面消毒，再用灭菌的蒸馏水冲洗干净，最后放入铺有湿润滤纸的培养皿中28 ℃黑暗催芽。摩西球囊霉菌种编号BJ01，购自北京市农林科学院植物营养与资源研究所。取自当地连栋日光温室，黄瓜连作年限为3年，采集耕层土，混匀，四分法取样，一部分风干用于基本理化性状测定，剩余部分用于盆钵试验。设施连作土壤基本理化性质：有机质含量37.2 g/kg，碱解氮102.15 mg/kg，速效磷91.82 mg/kg，速效钾215.06 mg/kg，pH 7.92。育苗容器：营养钵上底径10 cm、下底径6 cm、高12 cm，使用前用70%的酒精表面消毒，晾干备用。

1.2 试验设计

设施连作土壤共设灭菌与未灭菌2个水平。将设施连作土壤等分为2份，其中1份采用湿热灭菌法灭菌，即将土壤装入布袋，于高压灭菌锅内0.105 MPa条件下湿热灭菌30 min，土壤灭菌后平摊于通风处放置1周备用；另一份未灭菌，自然风干。最后，分别将灭菌土与未灭菌土装盆，每盆装土300 g。AM真菌共设置接种与不接种2个水平。接种AM真菌处理：在土壤表面平铺AM菌剂30 g。不接种AM真菌处理：土壤表面平铺30 g灭菌菌剂与30 mL菌剂滤液，以保证其他微生物种类与接种AM真菌处理相一致。将土壤处理（S）与AM真菌（M）两因素各设2个水平组合，共设4个处理：（1）S1M1处理，即土壤灭菌条件（S1）下，育苗时接种摩西球囊霉（M1）；（2）S1M0处理，即土壤灭菌条件下，育苗时不接种摩西球囊霉（M0）；（3）S0M1处理，即土壤未灭菌条件（S0）下，育苗时接种摩西球囊霉（M1）；（4）S0M0处理，即土壤未灭菌条件下，不接种摩西球囊霉（M0）。每处理15盆，共计60盆。于2019年9月在日光温室开展黄瓜育苗试验，选择芽长约1 cm的种子播于盆钵内，每盆播种2颗，出苗后每盆定植1株，置于日光温室常规管理，子叶展开后采用重量法浇水至田间持水量的60%，播种7周后收获。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 供试土壤基本理化性状测定参照鲍士旦（2000）的方法，有机质含量测定采用KCrO容量法—外加热法；碱解氮含量测定采用碱解扩散法；速效磷含量测定采用Olsen法；速效钾含量测定采用火焰光度法；土壤pH测定采用电位法。

1.3.2 幼苗生长相关参数测定幼苗收获后，迅速分割地上部与根系，清洗后吸水，每处理随机取5盆用于测定叶面积（Leaf area，LA）、菌根侵染率和根系活力，其中，叶面积测定采用打孔法，菌根侵染率测定采用根段法（Phillips and Hayman，1970），根系活力测定采用α-萘胺氧化法（李小方和张志良，2016）；新鲜样品经两步烘干后用于全氮、全磷和全钾含量测定，全氮、全磷和全钾含量测定分别采用奈氏比色法、钒钼黄比色法与火焰光度法（鲍士旦，2000）。根据测定结果计算菌根效应和菌根贡献率。

1.4 统计分析

试验数据应用SPSS 19.0进行分析，应用LSD方法进行多重比较，显著水平取0.05（≤0.05）。

2 结果与分析

2.1 灭菌处理对土壤基本理化性状的影响

从表1可知，土壤经121 ℃湿热灭菌30 min后，其肥力水平发生明显变化，尤以速效养分含量的变化最为明显。土壤速效养分是当季作物可吸收利用的养分，其含量高低与作物生长密切相关。与未灭菌处理相比，土壤灭菌后碱解氮、速效磷和速效钾含量均显著增加（＜0.05，下同），灭菌土壤的碱解氮、速效磷和速效钾含量分别是灭菌前的1.28、1.31和1.52倍。土壤经灭菌处理后可在一定程度上可增加土壤有机碳量，表现为土壤有机质含量较灭菌前增加15.67%。灭菌处理后，土壤pH较灭菌前升高约0.40。土壤活性酸可通过pH反映，土壤pH不仅关系到土壤中微量元素营养的有效性，也关系到植物根系对生长介质的耐受性，土壤pH的升高对于酸化的设施土壤而言为有益。

2.2 摩西球囊霉与土壤灭菌处理对黄瓜幼苗生长的影响

干重和叶面积是评价植株长势的重要参数。方差分析结果表明，土壤处理、摩西球囊霉及二者的互作对黄瓜幼苗的干重和叶面积均有极显著影响（＜0.01，下同），即土壤灭菌处理与接种摩西球囊霉均对幼苗干重和叶面积增加有极显著促进作用，且二者配合的作用也极显著。所有处理中以灭菌土上菌根化幼苗的长势最优（图1）。由表2可知，4个处理中，灭菌土上接种摩西球囊霉的黄瓜幼苗地上部干重、根系干重及叶面积均显著高于其他3个处理，较灭菌土上不接种摩西球囊霉处理分别增加46.58%、43.00%和35.16%；同时，在未灭菌土壤上，菌根化幼苗的长势优于非菌根化幼苗，即土壤未灭菌条件下，接种摩西球囊霉的黄瓜幼苗地上部和根系干重也显著高于相应的不接种摩西球囊霉处理，分别增加10.87%和17.69%，但叶面积无显著差异（＞0.05，下同）。因此，就摩西球囊霉与土壤处理对黄瓜幼苗生长的影响来看，土壤灭菌优于未灭菌处理，接种摩西球囊霉优于不接种摩西球囊霉。灭菌土上接种摩西球囊霉长势可达最优，即土壤灭菌条件下接摩西球囊霉对黄瓜幼苗生长有显著促进作用，此时，摩西球囊霉与黄瓜幼苗根系可建成良好的共生关系，侵染率高达42.30%。结合土壤灭菌条件下较高的菌根效应，可认为该AM真菌在土壤灭菌条件下具有较大的应用潜力。

2.3 摩西球囊霉与土壤灭菌处理对黄瓜养分吸收的影响

方差分析结果表明，摩西球囊霉、土壤处理及二者的互作对黄瓜幼苗根系活力、全氮、全磷及全钾养分吸收影响极显著，表明接种摩西球囊霉与土壤灭菌处理都能极显著提高根系活力并改善幼苗氮磷钾营养水平，且二者配合的效果也达极显著。

2.3.1 对黄瓜氮吸收的影响摩西球囊霉和土壤灭菌处理对黄瓜氮素吸收的影响见表3。无论接种摩西球囊霉与否，灭菌土上黄瓜幼苗的根系活力、全氮含量和单株氮吸收量均显著高于未灭菌处理，其中，未接种摩西球囊霉条件下，灭菌土上黄瓜幼苗的根系活力、全氮含量及氮吸收量分别是未灭菌处理的2.43、1.04和1.26倍。土壤灭菌后黄瓜幼苗对氮营养吸收能力的提高，一方面得益于连作土壤环境的改善，另一方面可能与高温条件下土壤氮水平变化有关。同时，无论土壤是否灭菌，摩西球囊霉对黄瓜幼苗根系活力及氮吸收都表现出显著的促进作用，摩西球囊霉对氮吸收的促进作用可通过菌根贡献率间接反映。灭菌土上的菌根贡献率远高于土壤未灭菌处理，土壤灭菌条件下，摩西球囊霉对氮吸收的贡献率是未灭菌处理的3.21倍，且未灭菌土上菌根化幼苗的全氮含量也达到灭菌土上不接种摩西球囊霉处理的全氮含量水平。此外，土壤处理与摩西球囊霉对黄瓜根系活力和氮吸收的促进效应以二者协同作用最为突出，即土壤灭菌条件下，菌根化幼苗的根系活力、全氮含量和氮吸收量分别为非菌根化幼苗的1.19、1.18和1.74倍，显著高于其他处理。土壤未灭菌条件下，接种摩西球囊霉的幼苗根系活力、全氮含量和单株氮吸收量分别为相应不接种摩西球囊霉处理的2.04、1.04和1.15倍。对比不同土壤处理条件下的菌根贡献率可知，土壤灭菌处理条件下，接种摩西球囊霉更有利于黄瓜对土壤中氮营养的吸收。

2.3.2 对黄瓜磷吸收的影响土壤的有效磷水平不仅是植株吸收利用磷营养的基础，同时也是AM真菌侵染植株根系的限制因素之一，通常介质中含有较高的有效磷不利于互惠共生体的建成。由表4可知，无论接种摩西球囊霉与否，与土壤未灭菌处理相比，土壤经灭菌处理后，黄瓜幼苗的全磷含量和单株磷吸收量均显著提高，这与土壤灭菌后速效磷含量增加有关。灭菌土上不接种摩西球囊霉的幼苗与菌根化苗的全磷含量分别为土壤未灭菌处理的1.48和1.85倍。与此同时，摩西球囊霉对黄瓜幼苗磷吸收的作用却因土壤处理而异，其中，土壤灭菌条件下，摩西球囊霉可明显提高黄瓜幼苗的全磷含量和单株磷吸收量，灭菌土上菌根化幼苗地上部全磷含量和单株磷吸收量分别为非菌根化幼苗的1.33和1.95倍。本研究中供试土样在灭菌前速效磷含量高达91.82 mg/kg，菌根贡献率达48.8%，结合摩西球囊霉在灭菌土上对黄瓜幼苗磷吸收的显著促进作用可看出，摩西球囊霉是一种耐高磷AM真菌。尽管如此，在未灭菌土上，摩西球囊霉对黄瓜幼苗地上部磷吸收并未表现出明显的促进作用，土壤未灭菌条件下，接种摩西球囊霉幼苗的地上部全磷含量和单株磷吸收量与其不接种摩西球囊霉处理间的差异均未达显著水平，且菌根贡献率仅15.5%。

2.3.3 对黄瓜钾吸收的影响由表5可看出，与氮磷相同，黄瓜幼苗不论是否接种摩西球囊霉，灭菌条件下幼苗的全钾含量和单株钾吸收量均显著高于土壤未灭菌处理，灭菌土上不接种摩西球囊霉的黄瓜幼苗全钾含量是未灭菌处理的1.21倍。摩西球囊霉对黄瓜幼苗钾吸收也具有促进作用，但促进的程度随土壤处理而变化，只有在土壤灭菌条件下，摩西球囊霉的促进作用才达显著水平，即土壤灭菌条件下，菌根化处理的黄瓜幼苗地上部全钾含量和单株钾吸收量为所有处理中最高，其中，菌根化处理的黄瓜幼苗地上部全钾含量和单株钾吸收量分别为非菌根化幼苗的1.31和1.92倍。然而，土壤未灭菌条件下，接种摩西球囊霉的幼苗地上部全钾含量与不接种摩西球囊霉处理间无显著差异，菌根化幼苗地上部全钾含量是非菌根化幼苗的1.11倍；同时，未灭菌土上菌根化幼苗的全钾含量与灭菌土上不接种摩西球囊霉处理间也未达到显著差异，这表明摩西球囊霉在未灭菌土上对黄瓜幼苗地上部钾营养有一定的改善作用，其改善作用与土壤只进行灭菌处理的效果相当。

3 讨论

3.1 土壤灭菌与连作障碍

连作是一种常见的农业栽培方式，尤其在设施条件下，随着栽培年限的增加，便引发了一系列连作障碍问题，对土壤和作物产生了诸多不利影响。其中，土壤质量会严重退化，主要表现为土壤酸化、盐渍化、养分失调、有机质含量下降、酶活性降低及重金属元素累积等。同时，土壤微生物环境也会遭到破坏，主要表现为细菌群落多样性降低、真菌多样性增加（卢维宏等，2020；Lei et al.，2020）。对于作物而言，因连作障碍造成的土壤营养元素亏缺限制了其生长发育，表现为作物各项生长指标受到不同程度的影响。此外，长期连作还会使作物土传病害及化感自毒作用加剧（苏一诺等，2019）。因此，改善土壤生态环境并培育适龄壮苗对缓解连作障碍至关重要。

土壤灭菌是农业生产中缓解连作障碍的重要措施之一。本课题组前期采用甲醛熏蒸的方法对设施黄瓜连作土壤进行消毒处理，将发育完善的菌根共生体移栽于消毒土壤上，移苗初期，地表球囊霉（）对津绿3号表现出明显的促生作用，直至生长后期，菌根效应逐渐消失（王倡宪等，2018）。结果表明，菌根效应的消失与后期土著菌的大量繁殖有关，这也间接反映出该灭菌方法存在灭菌不彻底的问题。该问题在以氯仿为熏蒸剂处理土壤的研究中得到证实（郑嘉慧等，2017）。此外，甲醛在杀灭土壤病原的同时，残留于土壤中的甲醛对AM真菌的消杀也是影响菌根效应的一个重要因素。相关研究表明，使用包括甲醛在内的诸多杀菌剂会在一定程度上抑制抑制AM真菌侵染寄主，进而降低菌根效应（Covacevich et al.，2014；濮春娟等，2021）；与之不同，高温蒸汽熏蒸具有较好的土壤微生物灭活效果，无化学药剂残留，且在一定程度上可改变土壤肥力状况。

3.2 高温灭菌对土壤养分的影响

本研究中，不接种摩西球囊霉条件下，连作土壤经灭菌处理后，幼苗根系干重和地上部干重均显著高于土壤未灭菌处理。众所周知，幼苗根系作为土壤环境变化最直接的感知器官，土壤的养分状况尤其是速效养分变化对其生长发育至关重要。诸多研究结果证实，土壤经灭菌处理后，有机质、有效磷和速效钾含量均会显著增加。其中，高温灭菌对土壤理化性状的影响与土壤有机质含量、粘粒含量及土壤种类等因素密切相关（张辉等，2011；倪国荣等，2018）。结合本研究结果，分析认为，土壤经灭菌处理后，肥力退化的土壤在一定程度上质量有所改善，有机质作为衡量土壤肥力水平的主要指标，其含量变化是土壤质量变化的直接体现。较高的有机质含量是植物保持良好长势的前提，与此同时，有机氮作为土壤氮的主要形态，需经过微生物参与的矿化作用，才能转化为植物可吸收利用的形态。高温杀灭了土壤微生物，生物固持氮量增加，间接增加了土壤氮矿化基质；在高温处理过程中，土壤水分发生变化，进而引起微生物活性变化，导致土壤氮水平改变，多方面综合作用的结果使土壤氮有效性增加。另外，灭菌处理对土壤供钾也会产生有益影响。矿物态钾是土壤钾的主要形态，是植株较难利用的钾形态，而高温处理使部分矿物态钾分解，这在一定程度上提高了土壤的供钾水平，为植株钾营养的改善打下基础。本研究中，土壤经121 ℃湿热灭菌30 min后，有机质含量约增加15%，pH升高约0.40，该探索性研究中所用土样虽然不是盆栽用土，相关机理尚待深入研究，但研究结果具有一定的普适性，推而广之，土壤经湿热灭菌后的这些微小的变化对于土壤因连作而造成的有机质含量降低及土壤酸化的缓解作用却不容忽视。

3.3 高温灭菌对土壤生物环境的影响

也有研究认为，土壤灭菌处理可基本消除因连作造成的不利影响，且土壤灭菌的主要作用是改善了前茬形成的土壤生物环境，而对土壤养分状况的变化无显著影响（Zurawicz et al.，2013）。土壤微生物作为生物环境的重要组成部分，其与土壤生态系统中养分的转化密不可分。有研究发现，土壤经121 ℃湿热灭菌3次、每次30 min，即可杀灭土壤中的所有微生物（曹鹏等，2016）。本研究中，在土壤灭菌条件下，接种摩西球囊霉的黄瓜长势最好，表现为幼苗地上部干重、根系干重和叶面积均显著高于其他处理。从共生体角度来看，这是共生体双方协同作用的结果，也是二者互惠效应的直接体现。一方面，灭菌处理杀死了土壤中包括病原菌和土著菌在内的微生物，从而降低了AM真菌与土著菌间的竞争作用，有利于AM真菌更好地侵染幼苗根系，此时菌根侵染率高达42.3%，远高于土壤未灭菌处理；另一方面，无病原菌生存的土壤环境更有利于幼苗根系生长，健壮的根系为AM真菌生长发育提供了充足的碳水化合物和脂类，这是AM真菌有益作用发挥的基础。鉴于盆栽试验的局限性，本研究中土壤经湿热灭菌后其微生物群落组成有待进一步深入研究。

3.4 高温灭菌对菌根效应的影响

根系活力是衡量植物根系对水分与养分吸收能力的重要指标，该指标对植物地上部的营养状况有直接影响（岳松青等，2019）。土壤灭菌处理为幼苗根系创造了良好的生长环境，这有利于根系更高效地吸收氮磷钾，这种吸收促进作用在接种摩西球囊霉后表现尤为明显，即灭菌土壤上接种摩西球囊霉后，黄瓜幼苗根系活力达最大，且菌根对养分吸收的贡献率都超过40%。本研究结果与紫花苜蓿、小麦和玉米等作物上得到的结论相一致（Biró et al.，2000；Miransari et al.，2009；张学林等，2021）。但在可可上的研究却发现，AM真菌对植株氮与磷营养水平的改善在未灭菌土壤上更明显（Aggangan et al.，2019）。氮磷钾作为植物营养三要素，在植物体内都有各自重要的营养功能（陆景陵，2003）。本研究结果表明，土壤无论灭菌与否，接种摩西球囊霉处理的黄瓜幼苗地上部全氮含量均显著高于不接种摩西球囊霉处理。已有研究证实，黄瓜幼苗各项生长指标的增加主要源于光合产物的积累，而光合产物的积累是叶绿素含量增加、光合速率加快、光合能力增强的结果（秦海滨等，2008；任志雨等，2008）。氮是叶绿素的重要组成元素，植物进行光合作用时光能的吸收依赖于叶绿素。因此，黄瓜幼苗地上部全氮含量的增加会间接促进其光合作用，加之较大的叶面积，最终使菌根化幼苗地上部生物量显著累积。磷在植物体中参与碳水化合物的代谢与运输，地上部较高的全磷含量有利于光合产物向根系运移，根系光合产物的显著增加为共生体的建成及互惠效应的发挥打下了基础。土壤未灭菌条件下，由于土著菌的存在，使得摩西球囊霉无法成为根际优势种，这也在一定程度上影响了摩西球囊霉对磷与钾吸收的促进作用。