一株具有烟草甲毒杀作用的苏云金芽孢杆菌对烟叶的影响

2022-09-05胡逸超陈义昌邹克兴邹承武

南方农业学报 2022年6期

胡逸超，苏赞，雷薇，陈义昌，邹克兴，陈琦*，邹承武

（1广西中烟工业有限责任公司技术中心，广西南宁 530001；2南宁国拓生物科技有限公司，广西南宁 530001；3广西大学农学院/植物科学国家级实验教学示范中心，广西南宁 530004）

0 引言

【研究意义】未处理的烟叶和成品烟均可能滋生烟草甲（），对烟草工业造成较大危害。据估计，烟草甲造成的损失占每年烟草总量的0.7%～1.0%（Famham et al.，2007；Edde，2019；夏丽媛等，2020）。目前主要采用熏蒸法防控烟草甲，此法虽然毒杀烟草甲的效果显著，但越来越多的研究表明烟草甲具有对磷化氢的基因遗传抗性，导致磷化氢使用量不断提高，引起了行业对食品安全的担忧，制定了更严格的法规制约磷化氢使用（齐绪峰等，2006a；吕建华等，2016）。因此，开发绿色环保的烟草甲防控技术成为新的研究热点。【前人研究进展】苏云金芽孢杆菌（，）在产孢的过程中会产生伴孢晶体，即杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins），对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目及同翅目等昆虫有特异性毒杀作用，而对环境和非靶标生物安全，因此广泛应用于农业生产的植物保护领域（Sanchis and Bourguet，2008；崔莹莹，2009；Sanahuja et al.，2011；Jouzani et al.，2017；胡逸超等，2020）。烟草甲作为鞘翅目昆虫，从仓储烟叶中分离对烟草甲幼虫具有杀虫活性的菌株用于生物防治烟草甲，预示了制剂在防治仓储烟叶害虫方面有广阔的应用前景（齐绪峰等，2006b）。有研究人员从2652株菌株中筛选出28株菌株产生的伴孢晶体具有毒杀烟草甲的作用，其中致死率最高的菌株毒杀率达45.3%（Tsuchiya et al.，2002）。胡逸超等（2019）从广西50份仓储烟叶中筛选获得1株菌株，其对烟草甲的毒杀率高达72.5%。使用产生的芽孢进行喷施是较为长效的防控烟草甲的方法，目前尚无研究表明的使用会对人体或动物产生危害（Sanahuja et al.，2011）。有研究指出，菌剂应用到烟叶上不影响烟叶的化学成分及评吸效果，但未见详细数据报道（Blanc et al.，2014）。在烟叶中添加微生物除了可用于防控虫害，还可能加速醇化速度或优化烟叶质量。Zhao等（2007）研究表明，微生物对于醇化过程中烟叶的香气改善和刺激性气味去除具有重要作用。微生物可通过代谢物和酶的作用促进烟叶中生物大分子的转化，从而减少烟碱、亚硝胺等有害成分，增加香味，改善品质特性（Maldonado-Robledo et al.，2003；Liu et al.，2015）。微生物菌剂的应用不仅会缩短烟叶发酵周期，还可改善烟叶香气（张亚恒等，2015）。芽孢杆菌处理会降低烟叶中的多种亚硝胺类物质（Wei et al.，2014）。由此可见，人为添加微生物可能会影响烟叶的醇化效果。【本研究切入点】目前，已有使用菌株对烟草甲进行防控的研究（齐绪峰等，2006b），但关于使用菌株对烟草各项品质指标及烟叶微生物多样性的影响尚未见文献报道。本团队前期研究发现1株对烟草甲具有较强毒杀率的菌株（胡逸超等，2019，2020），拟通过研究该菌株在烟草仓库中使用是否对烟叶的各项品质指标和烟叶微生物多样性造成影响，评估菌株用于烟草仓库毒杀烟草甲的应用前景。【拟解决的关键问题】对喷施菌剂并进行醇化后的烟叶进行化学成分和评吸分析，并通过16S rDNA扩增子高通量测序分析烟叶的细菌群落结构变化，以期为烟叶仓库中应用菌剂防控烟草甲的可行性和安全性评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用烟：2018年广西B3F复烤烟叶（广西中烟工业有限责任公司武鸣仓库）。试验菌株：从仓库贮烟中分离的具有烟草甲毒杀作用的苏云金芽孢杆菌GXZY032（胡逸超等，2019）。

1.2 Bt菌剂制备及试验设计

菌株GXZY032挑取单菌落经小体积培养活化后，按照1∶100的比例接种于1000 mL NB培养基中。培养72 h（30 ℃，200 r/min），通过显微镜镜检计数确认芽孢含量达10个/mL后，离心（8000 r/min，30 min）收集菌体及芽孢，用无菌水洗涤2次后去除上清，将菌体进行冷冻干燥，制成粉剂。按照1 kg烟叶施用0.1 g菌剂的比例，将菌剂均匀喷施到烟叶上。用牛皮纸包装烟叶，每件烟叶重约100 kg，于2018年4月放置于广西中烟工业有限责任公司武鸣厂区仓库内进行醇化，仓库温度维持在6～32 ℃，湿度控制在49%～94%。不施用菌剂的烟叶作为对照组，施用菌剂的烟叶作为处理组，每组均设3个重复。

1.3 烟叶化学成分测定及感官质量评价

1.3.1 样品采集烟叶进行醇化后，于第12个月开始，每隔2个月取样一次，采用五点取样法进行取样，取样位置至少距离上层烟叶15 cm，每次取样500 g，共采集7次。

1.3.2 烟叶化学成分测定分别参考YC/T 468—2013《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》、YC/T 161—2002《烟草及烟草制品总氮的测定连续流动法》、YC/T 159—2002《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》、YC/T 217—2007《烟草及烟草制品钾的测定连续流动法》、YC/T 162—2002《烟草及烟草制品氯的测定连续流动法》和YC/T 216—2013《烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》的方法测定烟叶总植物碱、总氮、总糖、还原糖、钾、氯和淀粉含量。化学成分分析使用AutoAnalyzer 3 HR连续流动分析仪（德国Seal Analytical公司），主要化学试剂均为分析纯。

1.3.3 感官质量评价依据YC/T 530—2015《烤烟烟叶质量风格特色感官评价方法》的方法，由广西中烟工业有限责任公司组织评吸专家对烟叶进行单体烟评吸，对香气质、香气量、杂气、刺激性、透发性、柔细度、甜度、余味、浓度和劲头等指标进行评价，评吸人数及评吸分数参照杨松等（2018）的方法。

1.4 烟叶细菌多样性分析

1.4.1 样品采集采集施用菌剂并醇化24个月后的烟叶作为处理组，以同时期未施用菌剂的烟叶作为对照组，每组设3个重复。

1.4.2 DNA提取采用多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，参照说明书提取样品基因组DNA。所得基因组DNA经NanoDrop 2000（美国ThermoFisher公司）检测纯度，Qubit3.0 Fluorometer荧光计（美国ThermoFisher公司）测定浓度。

1.4.3 16S rDNA扩增子测序采用引物341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTA CNNGGGTATCTAAT-3'）扩增细菌16S rDNA基因的V3～V4区（Sinclair et al.，2015），所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测及浓度检测，等量混池后使用TruSeq DNA PCR-free Sample Preparation Kit（美国Illumina公司）进行文库构建，具体操作步骤参照说明书。所得文库使用NovaSeq6000（美国Illumina公司）进行双端测序（Paired-End），双向各测250 bp。

1.5 数据分析

使用FLASH 1.2.7对测序所得reads进行拼接（Magoč and Salzberg，2011），Qiime 1.7.0过滤低质量tags，以UCHIME Algorithm获得Effective tags（Edgar et al.，2011），再用Uparse 7.0.1001进行聚类（Edgar，2013），相似性达97%的序列归为一个分类单位（Operational taxonomic units，OTU），选取频率最高的序列作为OTU序列。使用Mothur根据SILVA中的SSU数据库（Quast et al.，2013）对OTUs进行各分类水平注释，利用PyNAST 1.2（Yilmaz et al.，2013）对OTU序列发生关系进行计算，对各样品的数据进行均一化处理。根据所有样品的物种注释结果和OTUs丰度信息，将相同分类的OTUs信息合并处理得到物种丰度信息表。使用Qiime 1.7.0计算各样品的Alpha多样性指数。利用OTUs之间的系统发生关系，计算Unweighted unifrac（Unifrac）距离（Lozupone and Knight，2005），以OTUs丰度信息对Unifrac距离进一步构建Weighted Unifrac距离（Lozupone et al.，2007）。通过多变量统计学方法进行主坐标分析（Principal co-oridinates analysis，PCoA）。

组间差异显著性分析采用Student’stest（test）分析，＜0.05视为差异显著。根据分析所获得的数据，采用Prism 8.4.0绘制柱状图及散点图。

2 结果与分析

2.1 Bt菌剂处理对烟叶常规化学成分的影响

菌剂处理对烟叶常规化学成分的影响见表1。处理组烟叶的总糖、还原糖、总植物碱和淀粉平均含量高于对照组，而钾和总氮平均含量低于对照组。差异显著性分析结果显示，7种常规化学成分在2组之间无显著性差异（＞0.05，下同），表明菌剂处理不会在醇化时造成烟叶总糖、还原糖、氯、总植物碱、钾、总氮和淀粉等化学成分的明显变化。

2.2 Bt菌剂处理对烟叶感官质量的影响

菌剂处理对烟叶感官质量的影响见图1。随着醇化时间的延长，对照组和处理组烟叶香气量（图1-B）、浓度（图1-I）和劲头（图1-J）的得分表现出一定的降低趋势。综合来看，处理组烟叶的香气质（图1-A）、刺激性（图1-D）、透发性（图1-E）、柔细度（图1-F）、甜度（图1-G）、余味（图1-H）和劲头的平均评分稍低于对照组，其中香气质、透发性和甜度的平均评分在处理组和对照组间存在显著差异（＜0.05，下同）；处理组烟叶的香气量、杂气（图1-C）和浓度的平均评分高于对照组，其中香气量和杂气的平均评分在处理组和对照组间分别达显著和极显著（＜0.01）差异水平。因此，经菌剂处理的烟叶香气量增加、杂气减少。评吸总评分显示，对照组的总评分为50.46分，处理组的总评分为49.70分，二者间差异不显著（=0.5489）。

2.3 Bt菌剂处理对烟叶细菌群落的影响

2.3.1 细菌群落结构基于16S rDNA扩增子测序技术，共得到处理组和对照组样品有效片段（Effective tags）665994条，平均长度为414 bp，聚类分析共得到347条OTU。所有的OTU注释分类后，共有11门20纲51目90科225属68种。

图2显示，与对照组相比，经菌剂处理后的烟叶细菌群落结构发生明显改变。在纲水平上，处理组杆菌纲（Bacilli）的相对丰度最高（95.9%），其次为甲型变形菌纲（Alphaproteobacteria）（2.8%）；而对照组的丙型变形菌纲（Gammaproteobacteria）相对丰度最高（47.6%），甲型变形菌纲（33.7%）次之（图2-A）。在目水平上，处理组的主要组成有芽孢杆菌目（Bacillales，95.9%）、红细菌目（Rhodobacterales，1.2%）和立克次氏体目（Rickettsiales，1.0%）等；对照组的主要组成有肠杆菌目（Enterobacteriales，31.3%）、立克次氏体目（16.9%）和芽孢杆菌目（Bacillales，15.6%）等（图2-B）。在科水平上，处理组中相对丰度前三的分别为芽孢杆菌科（Bacillaceae，96.0%）、红细菌科（Rhodobacteraceae，1.2%）和无形体科（Anaplasmataceae，0.7%）；而对照组中相对丰度前三的科分别为肠杆菌科（Enterobacteriaceae，33.7%）、芽孢杆菌科（16.7%）和无形体科（8.9%）（图2-C）。在属水平上，芽孢杆菌属（，95.9%）、沃尔巴克氏体属（）（0.7%）和弧菌属（）（0.4%）等是处理组烟叶中主要的细菌属；而志贺氏大肠杆菌属（）（22.9%）、芽孢杆菌属（15.5%）和沃尔巴克氏体属（8.3%）是对照组烟叶中主要的细菌属（图2-D）。

2.3.2 Alpha和Beta多样性分析采用Alpha多样性分析，比较样品的细菌多样性指数（表2）。代表群落丰富度的指数Observed species和Chao1显示，处理组的细菌群落丰富度显著低于对照组。代表群落多样性的指数Shannon和Simpson显示，处理组的细菌群落多样性低于对照组，但不存在显著差异。所有样品的覆盖度指数Coverage均为99.9%，说明样品的测序结果合理且具有代表性。

基于主坐标分析（PCoA）对处理组和对照组烟叶细菌群落的Beta多样性进行分析，结果表明，处理组的细菌群落结构离散程度较对照组高（图3-A），2组之间的分离现象明显，说明2组间的群落结构差异较显著（图3-B）。

3 讨论

本团队在前期研究中，获得1株具有烟草甲毒杀作用的苏云金芽孢杆菌（胡逸超等，2019）。在烟叶醇化的前期喷施该菌株，可减少仓库中烟草甲的危害。醇化对于烟叶的香味具有重要作用，不同的醇化条件会导致烟叶的致香成分发生变化，从而影响烟叶的评吸质量（黄静文等，2010）。已有研究表明，细菌发酵的作用会对烟叶化学成分产生影响，不同菌株产生的效果不尽相同（高文霞等，2011；龙章德等，2014）。有研究发现，微生物的应用可能缩短烟叶发酵周期，改善烟叶香气（张亚恒等，2015；Liu et al.，2021）。在烟叶的风干过程中，添加芽孢杆菌可降低烟叶的有害物质亚硝胺含量（Wei et al.，2014）。综上所述，对于醇化过程的任何改变，包括添加微生物菌株，均有可能改变烟叶的醇化效果。虽然有研究报道应用到烟叶不影响其化学成分及评吸效果（Blanc et al.，2014），同时本研究所采用的菌株主要目的为防控烟草甲危害，但使用该菌剂处理烟叶是否会影响其品质尚未知。本研究的主要目的是阐明GXZY032菌株对烟叶醇化的影响，为后期该菌株的应用提供效益或安全方面的评价。

本研究结果表明，在长达2年的醇化中，使用苏云金芽孢杆菌GXZY032未对烟叶的化学成分造成显著影响。在感官质量的评估中发现，喷施GXZY032后，烟叶香气量提升、杂气改善；香气质、透发性和甜度则表现出一定程度的下降。尽管这5个感官质量评分在统计学上具有显著差异，但其平均值差异均小于5%。以往也有研究表明，采用不同方法进行烟叶醇化时，会造成某一感官指标更优而另一指标评分降低的现象（Li et al.，2020）。采用苏云金芽孢杆菌干粉，主要是考虑芽孢在烟草仓库中能存活的时间较久，可达到长期控制烟草甲的作用。本研究结果表明，芽孢形态的菌剂可能在烟叶醇化的过程中对感官质量有一定影响，但影响程度较低。综上所述，可见菌株GXZY032对烟叶化学成分和感官质量的影响较小，不会造成烟叶品质的明显下降，说明在仓储中使用该菌株防控烟草甲影响烟叶品质的风险较小。

烟叶中常见的细菌种类较多，主要有芽孢杆菌（）、假单胞菌（Pseudomonas）、鞘脂单孢菌（）、寡养单胞菌（）、欧文氏菌（）、泛菌（）、乳球菌（）、梭菌（）、葡萄球菌（）、肠杆菌（）和类芽孢杆菌（）等（Zhao et al.，2007；Huang et al.，2010；Su et al.，2011；Chopyk et al.，2017；Ye et al.，2017）。Zhou等（2020）研究表明，醇化的烟叶微生物组成中，丙型变形菌纲、肠杆菌目和肠杆菌科含量在各自分类水平上均为丰度最高的物种，属于最主要的细菌种类；本研究对照组中相对丰度最高的物种在纲、目和科这3个水平上与Zhou等（2020）的研究结果一致，说明不同仓库的醇化烟叶之间，优势细菌存在一定相似性。本研究中，菌株处理后的烟叶细菌群落Alpha和Beta多样性指数均降低，群落结构也较对照组表现出明显的差异，表明人为添加菌株改变了烟叶的细菌群落多样性和结构，与前人研究结果（Polenogova et al.，2021；Zhang et al.，2021）一致。处理组中相对丰度最高的OTU为芽孢杆菌且含量高达95.9%，可能与人为添加菌株会造成该菌株在烟叶中的定殖，进而产生细菌素，抑制其他细菌的生长有关（Cherif et al.，2008）。同时，菌株处理明显降低了烟叶肠杆菌目的相对丰度。肠杆菌目的细菌作为一种食品污染指示菌，在食品中丰度降低有利于食品安全（Amorim and Nascimento，2017）。然而，也有研究表明，人为添加苏云金芽孢杆菌杀虫剂在食品中会有残留，对于其残留可能带来的风险引起了人们对食品安全的担忧（Frederiksen et al.，2006；Johler et al.，2018）。为防控烟草甲而添加的苏云金芽孢杆菌是否会影响香烟的安全使用，仍需进一步研究。