茶树对茶棍蓟马和茶小绿叶蝉抗性与叶片结构的关系

孟泽洪，杨 春，李 帅，陈正武，周玉锋

（贵州省农业科学院 茶叶研究所，贵州 贵阳 550006）

茶树[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]是我国重要的叶用经济作物，害虫取食危害叶片是降低茶叶产量和质量、影响茶叶经济效益的主要因素[1]。茶棍蓟马（Dendrothrips minowaiPrieser）和茶小绿叶蝉（Empoasca onukiiMatsuda）是贵州茶园中的主要害虫[2-4]，其以成、若虫吸食茶树幼嫩芽叶汁液危害茶树，具有发生代数多、田间各虫态混杂、世代重叠、隐蔽性强等特点[5-6]，防治难度较大，对茶叶产量和质量带来严重危害。

植物的叶片不仅是重要的营养器官[7]，也是植食性害虫取食、产卵的主要场所[8]。角质层、气孔、茸毛、蜡质等叶表性状在一定程度上可以影响害虫的栖息、取食、繁殖等，是榕树抗蓟马[9]、紫花苜蓿抗蓟马[10]、黄瓜抗白粉虱[11]的关键。茶树叶片的物理结构同样对茶树抗感害虫造成一定影响，栅栏组织、角质层和下表皮较厚的茶树品种更抗黑刺粉虱和茶蚜[12-13]，而气孔密度大的茶树品种更易感黑刺粉虱和茶蚜[12-14]。茶棍蓟马和茶小绿叶蝉是贵州茶园的主要害虫，前期已针对茶棍蓟马和茶小绿叶蝉的空间分布[15]、发生动态[16]等开展了相关研究，但茶树叶片物理结构尤其是叶片超微结构与茶棍蓟马和茶小绿叶蝉抗性关系方面的研究少见报道。鉴于此，以贵州主栽12 个茶树品种为试验材料，采用石蜡切片和扫描电镜，测量茶树叶片解剖结构和叶片微形态结构，将叶片结构性状与茶棍蓟马和茶小绿叶蝉虫量比值进行关联分析，探讨影响茶树品种抗虫性的关键叶片结构性状，为茶树抗性品种的快速鉴定提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 茶树品种

供试茶树包括白叶1 号（BY1）、保靖黄金茶（BJHJC）、中茶108（ZC108）、黔茶1 号（QC1）、福鼎大白茶（FDDBC）、苔选0310（TX0310）、黔辐4 号（QF4）、金观音（JGY）、乌牛早（WNZ）、黔茶8 号（QC8）、黄金芽（HJY）、黔湄601（QM601）共12 个品种，为贵州省主栽茶树品种。

2020 年9 月在贵州省农业科学院茶叶研究所黔中基地（26°31′26″N、106°39′25″E）内，采集供试茶树品种当年生枝条上健康完整的成熟茶树叶片为试验材料，制作石蜡切片标本和扫描电镜样本。所有茶树品种均为6 年生成年茶树，且处于同一生境、同一管理模式下。

1.2 检测方法

1.2.1 石蜡切片 取叶片中间叶脉旁10 mm×10 mm新鲜组织，用固定液固定24 h以上，乙醇梯度脱水、浸蜡、包埋、切片，厚度4µm，番红-固绿双重染色，中性树胶封片。在Nikon ECLIPSE Ci 正置荧光显微镜及其成像系统下观察、拍照，通过Case viewer软件测量其草酸钙晶体密度、海绵组织厚度、上表皮厚度、叶片厚度、栅栏组织密度、角质层厚度、下表皮厚度、栅栏组织层数、栅栏组织厚度，并计算组织比、叶片紧密度、叶片疏松度。

每个品种3 个制片，每个制片取3 个切片进行测量，所有数据重复数9个。

1.2.2 扫描电镜 取叶片中间叶脉旁1 mm×1 mm新鲜组织用电镜固定液固定，对样品进行清洗、脱水、干燥、装台，置于冷场发射扫描电镜下观察叶面和叶背，通过Image J 软件对微形态性状特征进行测量[17]。

每个品种制2 个样品，每个性状拍摄5 个观测面，各性状特征的观察与测量重复10次。

1.3 供试品种抗性表现

12 个茶树品种对茶棍蓟马和茶小绿叶蝉的抗性表现参考前期报道[16]，虫量比值及抗性等级详情见表1。

表1 12个茶树品种对茶棍蓟马和茶小绿叶蝉的抗性表现Tab.1 Resistance performance of 12 tea varieties to D.minowai and E.onukii

1.4 数据分析

1.4.1 计算公式 气孔器大小=外气孔长×外气孔宽[17]；气孔开度=内气孔宽÷内气孔长[17]；组织比=栅栏组织厚度÷海绵组织厚度[18-19]；叶片紧密度=栅栏组织厚度÷叶片厚度×100%[18-19]；叶片疏松度=海绵组织厚度÷叶片厚度×100%[18-19]；草酸钙晶体密度=草酸钙数量÷观测面积；气孔开放率=开放气孔数÷全部气孔数[20]；栅栏组织密度为100µm 内第1 层栅栏组织细胞的排列数量[21]。

1.4.2 数据处理 利用Microsoft Excel 2010 软件（美国微软公司产品）对试验数据进行统计处理，采用IBM SPSS 21.0 软件（美国IBM 公司产品）进行差异显著性检验（Duncan’s 新复极差法）和相关性分析（Spearman相关系数）。

2 结果与分析

2.1 不同茶树品种的叶片解剖结构分析

不同茶树品种在角质层厚度、海绵组织、栅栏组织等叶片解剖结构上差异明显（表2）。12个茶树品种叶片厚度在241.5～341.2 µm，高抗茶棍蓟马品种黔辐4 号和苔选0310 的叶片厚度分别是341.2µm 和338.0 µm，显著大于其他品种；角质层厚度在2.2～3.6 µm，福鼎大白茶和黔茶1 号角质层厚度显著大于其他品种，分别为3.6 µm 和3.4 µm，高抗茶棍蓟马品种黔辐4 号、苔选0310 与高感品种中乌牛早、中茶108 间无显著差异；上表皮厚度在16.3～28.9 µm，黔辐4 号和苔选0310 上表皮厚度显著大于其他品种，分别为28.9 µm 和25.8 µm；下表皮厚度在14.7～20.0 µm，高抗茶棍蓟马品种黔辐4号、苔选0310与高感品种金观音间无显著差异，但显著大于高感品种乌牛早和中茶108；高抗茶棍蓟马品种黔辐4 号和苔选0310 栅栏组织有3 层，保靖黄金茶和乌牛早栅栏组织为1 层，其他品种栅栏组织为2层；栅栏组织厚度在49.8～112.9µm，黔辐4号和苔选0310栅栏组织厚度显著大于其他品种，分别为112.9 µm 和112.2 µm，乌牛早栅栏组织厚度最低，仅为49.8µm；海绵组织厚度在130.6～176.4µm，黔辐4 号和苔选0310 的海绵组织厚度较大，分别为176.4 µm 和174.9 µm；乌牛早组织比最低，为0.3，其他茶树品种组织比集中在0.5～0.7；栅栏组织密度为100 μm内6.2～8.3个，其中黄金芽、苔选0310和黔湄601 栅栏组织密度较大，100 μm 内均大于8 个。12个茶树品种叶片解剖结构紧密度或疏松度存在明显差异，乌牛早为疏松度最大、紧密度最小的一个品种。茶树叶片中存在形状不规则的草酸钙晶体，12 个茶树品种草酸钙晶体数在0.8～2.2 个/mm2，高感茶小绿叶蝉品种福鼎大白茶中草酸钙晶体数最少，白叶1 号、黔湄601、苔选0310 和黔辐4 号中草酸钙晶体数较多，均在2个/mm2以上。

表2 12个茶树品种的叶片解剖结构Tab.2 Leaf anatomical structure of 12 tea varieties

2.2 不同茶树品种的叶片微形态结构分析

茶树叶片的微形态指标主要集中在气孔和茸毛，12个茶树品种的多个微形态指标均存在较大差异（表3）。内气孔长在9.7～16.1 µm，中茶108 和黔茶8 号内气孔长显著大于金观音以外的其他品种；内气孔宽在2.4～6.0µm，茶棍蓟马抗性不同的茶树品种内气孔宽差异明显，高抗、抗、中抗茶棍蓟马的茶树品种叶片内气孔宽低于4µm，感和高感茶棍蓟马的茶树品种内气孔宽在4.5µm 以上；外气孔长在20.2～32.9 µm，黔茶8 号外气孔长显著高于黄金芽以外的其他品种，黔湄601 外气孔长显著低于其他品种；外气孔宽在17.0～25.1 µm，其中黔湄601、苔选0310 和黔茶1 号外气孔宽相对较小，均在20µm以下。12 个茶树品种气孔开度差异较小，为0.2～0.4，高抗茶棍蓟马品种黔辐4号和苔选0310气孔开度较小，均在0.2 左右；气孔器大小在346.2µm2（黔湄601）～767.5µm2（黔茶8 号），其中黔茶8 号、黄金芽和乌牛早气孔器大小在700µm2以上，黔湄601气孔器显著小于黔茶1 号以外的其他品种；气孔密度在220.7～482.9个/mm2，高感茶棍蓟马茶树品种金观音和中茶108 气孔密度显著小于其他品种，高感茶小绿叶蝉茶树品种福鼎大白茶气孔密度最大。12个茶树品种气孔开放率在28.2%～92.4%，差异较大，高抗茶棍蓟马茶树品种气孔开放率分别为59.0%（黔辐4号）和28.2%（苔选0310），高感茶棍蓟马茶树品种则分别为77.5%（金观音）、87.3%（中茶108）和90.5%（乌牛早），高感茶棍蓟马茶树品种气孔开放率显著大于高抗品种。

表3 12个茶树品种的叶片微形态结构Tab.3 Leaf micromorphology of 12 tea varieties

12 个茶树品种叶片茸毛长度在343.7～698.8µm，除金观音外，其余茶树品种叶片茸毛长度均在500µm 以上；叶片茸毛直径在8.4～13.9µm，叶片茸毛密度在2.2～13.0 个/mm2，茶棍蓟马不同抗性品种间叶片茸毛密度差异较大，高抗茶棍蓟马品种叶片茸毛密度显著高于高感品种，如黔辐4 号和苔 选0310 分 别 是12.6 个/mm2和10.4 个/mm2，金 观音、中茶108、乌牛早则为2.5、2.8、3.7 个/mm2。叶表蜡质纹饰形状在植物分类与鉴定中应用较为广泛，参考杨国一等[19]的方法，将茶树叶片表面纹饰分为3 种，依据起伏程度分为平展状、波浪状和皱脊状，12 个茶树品种中抗茶棍蓟马品种多为波浪状或皱脊状，而感茶棍蓟马品种均为平展状。茸毛纹饰形状同样分为3 种，即平滑型、短棒型和长条纹型，不同抗性品种间茸毛纹饰形状差异不大，多数品种茸毛纹饰形状为平滑型。

2.3 茶树叶片结构与茶棍蓟马和茶小绿叶蝉抗性的关联分析

利用Spearman 相关系数对叶片结构性状与茶棍蓟马和茶小绿叶蝉虫量比值进行线性相关分析（表4）。叶片解剖结构性状和叶片微形态结构性状与茶棍蓟马和茶小绿叶蝉虫量比值间的相关系数差异较大，其中，叶片解剖结构性状中仅草酸钙晶体密度、栅栏组织密度分别与茶棍蓟马虫量比值、茶小绿叶蝉虫量比值呈显著负相关，相关系数分别是-0.616（P=0.033）和-0.655（P=0.021）。仍有数个叶片解剖结构性状与茶棍蓟马或茶小绿叶蝉虫量比值存在较大的相关系数，其中栅栏组织层数与茶棍蓟马和茶小绿叶蝉虫量比值的相关系数分别是-0.538 和-0.425，说明栅栏组织层数较多的品种表现出一定的抗茶棍蓟马和茶小绿叶蝉性能。上下表皮厚度与茶棍蓟马虫量比值呈负相关，而与茶小绿叶蝉虫量比值呈正相关。

表4 茶树叶片结构性状与茶棍蓟马和茶小绿叶蝉虫量比值的相关系数Tab.4 Correlation coefficient between leaf structure traits of tea tree and pest number ratio of D.minowai and E.onukii

13 个叶片微形态结构性状与茶小绿叶蝉虫量比值均不存在显著相关性，而叶片微形态结构中多个指标与茶棍蓟马虫量比值显著相关。其中，内气孔宽、气孔开度和气孔开放率分别与茶棍蓟马虫量比值呈极显著或显著正相关，相关系数分别是0.846（P=0.001）、0.706（P=0.010）和0.669（P=0.017）。叶片茸毛密度、气孔密度和叶表蜡质纹饰形状与茶棍蓟马虫量比值均呈显著负相关，相关系数 分 别 为-0.601（P=0.039）、-0.587（P=0.045）和-0.626（P=0.029）。除此之外，叶片茸毛直径和茸毛长度与茶棍蓟马虫量比值呈负相关关系，内气孔长、外气孔长、外气孔宽与茶棍蓟马虫量比值呈正相关关系，但均未达到显著水平。

3 结论与讨论

茶棍蓟马和茶小绿叶蝉不同抗性茶树品种在叶片解剖结构和微形态结构上存在一定差异，高抗茶棍蓟马品种上表皮厚度、栅栏组织厚度、叶片茸毛密度显著大于高感品种，气孔开放率显著小于高感品种；高感茶小绿叶蝉品种福鼎大白茶中草酸钙晶体数最少。相关性分析显示，茶树品种对茶棍蓟马的抗性与气孔密度、叶片茸毛密度、草酸钙晶体密度、叶表蜡质纹饰形状呈显著正相关，与气孔开度、气孔开放率呈显著负相关，与内气孔宽呈极显著负相关；栅栏组织密度与茶树对茶小绿叶蝉抗性呈显著正相关。叶片多个物理性状与茶树对茶棍蓟马抗性显著相关，气孔和茸毛是决定茶树品种抗茶棍蓟马与否的关键。茶树叶片物理结构与其对茶棍蓟马的抗性关联强于与其对茶小绿叶蝉的抗性关联，说明蓟马这一类体形微小的昆虫可能更易受到植株叶片物理结构的影响。

与幼嫩芽叶相比，成熟叶片更多的是成为植食性昆虫的栖息和繁殖场所[22-23]。成熟叶片表面特性同样与植物抗虫性关系密切，茸毛是影响植食性昆虫栖息繁衍的重要因素[24]，具有较长、较密叶片茸毛的品种通常抗性较佳，在辣椒对侧多食跗线螨[25]、棉花对斜纹夜蛾[26]和黄瓜对白粉虱[11]的抗性研究中均有体现。本研究发现，成熟叶片茸毛密度与茶棍蓟马虫量比值呈显著负相关，茸毛长度与茶棍蓟马虫量比值呈负相关但未到显著程度，而前期研究显示，芽头茸毛长度与茶棍蓟马虫量比值呈极显著负相关，芽头茸毛密度与茶棍蓟马虫量比值呈显著负相关[16]。这说明提供茶棍蓟马栖息繁衍场所的成熟叶片，其茸毛性状对茶棍蓟马的影响小于幼嫩芽叶部位对茶棍蓟马的影响。但同样，对于茶棍蓟马这一类体形微小、活动性不强的植食性昆虫而言，过多过长的叶片茸毛可能在一定程度上影响其行动或产卵。

叶片茸毛与茶树对茶小绿叶蝉抗性的关系在不同研究中结果有所差异。金珊[27]研究发现，抗茶小绿叶蝉茶树品种的茸毛长度和密度均显著大于感虫品种。刘丰静等[28]研究发现，叶片茸毛密度与茶树对茶小绿叶蝉的抗性呈显著正相关，而茸毛长度与其呈显著负相关。本研究发现，叶片茸毛密度大，茶树对茶小绿叶蝉的抗性反而较弱，而叶片茸毛长度长，茶树对茶小绿叶蝉的抗性则较强，但相关性均未达显著水平。因此，叶片茸毛性状与茶树对茶小绿叶蝉抗性间的关系有待进一步研究。

气孔是另一个与植物抗虫性关联较大的叶片性状，气孔密度是其中的一个重要指标。在不同研究中气孔密度对植物抗虫性起着不同的作用。一方面，多个研究表明，气孔密度越大，抗虫性越弱。这一结论在水稻对稻瘿蚊[29]、柑橘对柑橘木虱[30]、西瓜对蚜虫[31]、木薯对朱砂叶螨[32]、枸杞对枸杞木虱[33]等的抗性研究中均有体现。茶树抗黑刺粉虱和茶蚜的研究也表明，气孔密度与品种抗性呈负相关[12-13]。另一方面，也有研究表明，气孔密度越大抗性越强。余德亿等[9]研究发现，高抗蓟马榕树品种气孔密度最大，高感品种气孔密度和长度均较小。本研究中，气孔的多个性状与茶棍蓟马抗性关联密切，气孔密度与茶树对茶棍蓟马的抗性呈显著正相关，气孔开放率和气孔开度与茶树对茶棍蓟马的抗性呈显著负相关，内气孔宽与茶树对茶棍蓟马的抗性呈极显著负相关。说明叶片单位面积内气孔数量较多，但处于关闭状态的气孔数量较多，且开放气孔开度小、内气孔较窄的茶树品种可能在一定程度上不利于茶棍蓟马繁殖。

草酸钙晶体也是叶片防御植食性昆虫取食的关键[34-35]。黄保国等[36]研究发现，白魔芋花器官中高浓度的草酸钙晶体是其防御隐翅虫的关键。茶树叶片中同样分布着草酸钙晶体，且不同茶树种质草酸钙晶体数量差异较大[37]。本研究中，不同抗性茶树品种叶片中草酸钙晶体数差异明显，高感茶小绿叶蝉茶树品种福鼎大白茶叶片中草酸钙晶体数最少，仅0.8 个/mm²，而高抗茶树品种黔湄601 草酸钙晶体数量达2.2 个/mm²。草酸钙晶体数与茶树上茶棍蓟马和茶小绿叶蝉发生量均为负相关，其中与茶棍蓟马发生量呈显著负相关，可能是叶片内较多的草酸钙晶体不利于刺吸性害虫取食或产卵。