苔藓植物醇提液对细菌的体外抑菌作用

张 春，骆 强，冯 图

（贵州工程应用技术学院生态工程学院，贵州 毕节 551700）

苔藓植物(Bryophytes)喜欢阴暗潮湿的环境，通常生长在裸露的石壁、潮湿的森林和沼泽等地。[1]苔藓植物即使在含有大量微生物的土壤或腐殖质上生长，也不容易被细菌或真菌感染[2]。研究表明，苔藓植物通过次生代谢可以产生丰富的次生代谢产物，如萜类、黄酮类、脂肪酸以及一些生物活性物质，是潜在的天然活性产物宝库[3]。目前，已有多种苔藓植物被证明具有抑制微生物活性的作用[4]，博雷克（Borelc）等研究了地衣的抑菌物质[5]。巴兹尔（Basilea）等从4种苔藓植物中提取出牡荆葡基黄酮和黄酮类化合物，发现黄酮类化合物对8种细菌有较强的抗菌性[6]。范·霍夫（Van Hoof）研究了20种苔藓植物提取液抗细菌和抗真菌活性[7]。沙伟等利用滤纸片法对9种苔藓植物抑菌能力进行研究，发现9种苔藓植物中多数种类对目的菌株具有一定的抑制作用[8]。沙伟还对16种苔藓植物对植物病原菌的抑菌性进行了研究[9]，表明多数苔藓植物提取物对4种植物病原菌的生长表现出抑制作用。程辉彩[10]等研究了24种藓类的乙醇提取物对病原真菌的抑制作用，陈锡雄[11]等对尖叶提灯藓的抑菌性进行了初步研究，吴昆对贵州省4种藓类植物抑菌性做了比较[12]。全世界苔藓植物约23000种，现已研究了抑菌性的苔藓植物种类还非常少，对苔藓植物抑菌性的研究还有很大的空间。

本研究通过对8种苔藓植物的抑菌性实验，探究苔藓植物不同种之间抑菌性的差异，从而为苔藓植物的种间差异、资源保护和筛选药用苔藓植物及进一步开发利用等提供基础数据。

1 研究材料与方法

1.1 研究材料

11种供试细菌为：表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、铜绿假单孢菌（Pseudomonas aerugi-nosa）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi-B），均来源于上海鲁微科技公司。

供试材料为8种苔藓植物，详见表1。

表1 标本名称及采集地点

1.2 研究方法

1.2.1 供试样品处理

苔藓植物提取液制备：从野外采集全株苔藓植物样品，反复用自来水冲洗，然后用去离子水清洗3次，放入烘箱中，50℃恒温条件下烘干24小时，用电动粉碎机将苔藓植物体粉碎。取样品粉末2.0g，置于具橡胶塞的三角瓶中，加无水乙醇20ml，摇床上振荡提取20h，以1500 r/min离心10min，收集上清液，将残渣再用无水乙醇重复提取2次，方法同上。合并3次的提取液于小烧杯中，置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 培养基的制备

根据实验所需培养基类型配置液体培养基和固体培养基，液体培养基的配置：蛋白胨10g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，将称好的药品置于烧杯中，加入少量蒸馏水，用玻璃棒搅拌，加热溶解，待全部药品溶解后，加水至所需体积1000mL，利用0.5mol/L NaOH将pH调制7.2～7.4，之后过滤、分装、灭菌，最后将配置好的培养基放入4℃的冰箱中保存备用。固体培养基的配置是蛋白胨10g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15g，除无需过滤外，其余步骤同液体培养基制备。

1.2.3 菌悬液的制备

取供试细菌菌株，用接种环各取菌苔少许接种至牛肉膏、蛋白胨固体培养基斜面上，在37℃恒温培养箱中培养20h活化，然后将活化后的菌株接一环于5mL液体培养基中，在恒温振荡器中37℃下培养6～8h，即制成菌悬液。

1.2.4 滤纸片法测定抑菌作用

取直径12mm的灭菌滤纸片放入上述苔藓植物提取液中浸泡过夜，将菌悬液各取0.5 mL与相应的固体培养基制成含菌平板，用无菌镊子取含浸出液的滤纸片贴在含菌平板上，每皿贴4片，每菌做3次重复，且用无水乙醇浸泡滤纸片作空白对照，置于37℃恒温培养箱中培养24 h后，用游标卡尺以十字交叉法测定抑菌圈直径[13]。

1.2.5 实验数据处理

由于8种苔藓植物抑菌活性物质均用无水乙醇提取，无水乙醇的抑菌直径均值为对照组。采用系统聚类法首先将各样本看成一类，有抑菌性记为1，无抑菌性记为0，使用IBM SPSS Statistics 23分析软件对数据进行整理和分析，利用欧式距离计算样品间距离，用最短距离法计算类群间距离，按系统聚类分析方法对其进行聚类分析。

2 结果分析

2.1 单种苔藓植物醇提液抑菌性分析

首先比较苔藓植物抑菌圈直径与对照组无水乙醇抑菌圈直径，大于无水乙醇抑菌圈直径的为有抑菌性，小于等于无水乙醇抑菌圈直径的视为无抑菌性，有抑菌性的苔藓植物，其抑菌圈直径再与对照组无水乙醇抑菌圈直径做独立样本t检验，P＜0.01为差异极显著，P＜0.05为差异显著。结果见表2。

表2 8种苔藓植物提取液对11种细菌抑菌圈直径/mm

从表2可见，金发藓、泥炭藓、粗叶青毛藓、节茎曲柄藓和桧叶白发藓醇提液有较强的抑菌广泛性，金发藓醇提液能有效抑制除枯草芽孢杆菌外的10种供试细菌，且对乙型副伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性与对照组相比有极显著差异，对铜绿假单孢菌、化脓性链球菌、伤寒沙门氏菌的抑菌性与对照组相比有显著差异。泥炭藓醇提液能有效抑制除副溶血性弧菌和白色葡萄球菌外的9种供试细菌，其中对铜绿假单孢菌、伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌的抑菌性与对照组相比有极显著差异，对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌的抑菌性与对照组相比有显著差异。粗叶青毛藓醇提液能有效抑制除铜绿假单孢菌和大肠杆菌外的9种供试细菌，其中对乙型副伤寒沙门氏菌的抑菌性与对照组相比有极显著差异，对化脓性链球菌、伤寒沙门氏菌的抑菌性与对照组相比有显著差异。节茎曲柄藓醇提液和桧叶白发藓醇提液对副溶血性弧菌、白色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌无抑菌性，对其余8种供试细菌均有抑菌性。其中节茎曲柄藓对乙型副伤寒沙门氏菌抑菌作用与对照组相比有极显著差异，对铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性与对照组相比有显著差异，桧叶白发藓对乙型副伤寒沙门氏菌抑菌作用与对照组相比有显著差异。

克什米尔曲尾藓醇提液、尖叶扭口藓醇提液和卵叶泥炭藓醇提液分别对6种供试细菌有抑菌作用，克什米尔曲尾藓醇提液对铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯氏菌、伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌有抑菌作用，其中对乙型副伤寒沙门氏菌的抑菌性与对照组相比有极显著差异，对化脓性链球菌的抑菌性与对照组相比有显著差异。尖叶扭口藓对表皮葡萄球菌、铜绿假单孢菌、肺炎克雷伯氏菌、伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌具有抑菌作用，且对铜绿假单孢菌和乙型副伤寒沙门氏菌的抑菌作用与对照组相比有显著差异。卵叶泥炭藓醇提液对表皮葡萄球菌、铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌有抑菌作用，且对化脓性链球菌、乙型副伤寒沙门氏菌抑菌作用与对照组相比有极显著差异，对伤寒沙门氏菌的抑菌作用与对照组相比有显著差异。

2.2 单种细菌中不同苔藓植物抑菌性分析

对8种苔藓植物醇提液的抑菌性效果进行了独立样本t检验，P＜0.05为显著，P＜0.01为极显著。在铜绿假单孢菌、伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌三种细菌中，苔藓植物的抑菌作用表现出差异性，铜绿假单孢菌中泥炭藓醇提液与克什米尔曲尾藓醇提液、桧叶白发藓醇提液、卵叶泥炭藓醇提液的抑菌作用相比有显著差异。伤寒沙门氏菌中泥炭藓醇提液与桧叶白发藓醇提液的抑菌作用相比有极显著差异。乙型副伤寒沙门氏菌中克什米尔曲尾藓醇提液、泥炭藓醇提液、卵叶泥炭藓醇提液与节茎曲柄藓醇提液、桧叶白发藓醇提液、尖叶扭口藓醇提液抑菌作用相比有显著差异。其余菌种中8种苔藓植物醇提液抑菌性比较无差异。门氏菌抑菌性O：泥炭藓醇提液对乙型副伤寒沙门氏菌抑菌性P：桧叶白发藓醇提液对表皮葡萄球菌抑菌性

图1 部分苔藓植物抑菌活性照片

2.3 聚类分析

从聚类图可见，T=2时，节茎曲柄藓和桧叶白发藓聚为一类，说明两种苔藓醇提液抑菌性具有极大的相似性。T=11时，克什米尔曲尾藓和卵叶泥炭藓聚为一类，T=13时，节茎曲柄藓、桧叶白发藓、金发藓和泥炭藓聚为一类，两大类在T=16时聚为一类。尖叶扭口藓和粗叶青毛藓分别在T=23和T=25时与其他苔藓聚为一类，说明在两种苔藓醇提液的抑菌性与其他6种苔藓植物醇提液抑菌性有明显差异。

图2 8种苔藓植物抑菌作用聚类图

3 讨论和结论

实验结果表明，8种苔藓植物均有广泛的抑菌作用。通过对抑菌作用的比较发现，已明确有药用功效的泥炭藓醇提液和金发藓醇提液对11种细菌的抑菌效果总体要强于其余6种苔藓植物醇提液的抑菌效果。本实验中还发现粗叶青毛藓醇提液、节茎曲柄藓醇提液具有广泛的抑菌性，且粗叶青毛藓醇提液对化脓性链球菌、伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌抑菌效果明显，节茎曲柄藓醇提液对铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌抑菌效果明显，但目前未将粗叶青毛藓和节茎曲柄藓列为药用苔藓植物[14-17]。可见还需对苔藓植物进行抗菌性筛查，以期找出既能广泛抗菌且抗菌效果好的苔藓植物，及时对这些苔藓植物资源进行保护。

节茎曲柄藓和桧叶白发藓对11种细菌的抑菌性达到高度统一，说明它们的次生代谢产物有着很大的相似性，贾渝、何思也在2013年的《中国生物物种名录》（第一卷苔藓植物）中将曲柄藓属放在了白发藓科中[18]。泥炭藓和卵叶泥炭藓同属泥炭藓属，在供试的11种细菌中，它们对8种细菌是否有抑菌作用是统一的，可见它们的次生代谢产物种类既具相似性，但又有区别。

从8种苔藓植物醇提液抑菌活性来看，与对照组相比有显著差异的并不是大多数，只有一部分种类的醇提取液抑菌活性相对较强，此结果与王丹对67种苔藓植物的抑菌活性研究有相似性[19]。11种细菌中，伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌对8种苔藓植物醇提液最为敏感，8种苔藓植物醇提液均对其有抑制作用。8种苔藓植物醇提液对乙型副伤寒沙门氏菌的抑菌效果最好，抑菌效果与对照组相比有显著差异。

苔藓植物有抑菌性的主要原因是能产生一些次生代谢产物，藓类的主要次生代谢产物为黄酮、三萜、甾醇化物和长链不溶性脂肪酸等。从本次实验还可以看出，苔藓植物中确实含有某些抑菌活性的次生代谢产物，且部分物质可以溶于有机溶剂乙醇中，后继应对有明显抗菌作用的苔藓植物做更进一步的研究，以期筛选出新的药用苔藓植物。