流水和循环水养殖模式对虾养殖系统运行稳定性和细菌群落演替规律

2022-09-02王青瑶吴俊敏申旭东傅松哲

渔业现代化 2022年4期

张晋，周灿，王青瑶，吴俊敏，申旭东，傅松哲，刘鹰

(1 大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁大连 116023;2 设施渔业教育部重点实验室，辽宁大连 116023;3 中国水产科学研究院营口增殖实验站，辽宁营口 115004)

凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)已成为全世界养殖产量最高的对虾种类[1]。目前中国是世界上主要的凡纳滨对虾养殖大国[2]。2019年，全国凡纳滨对虾养殖总产量为181.56万t，比上年增长3.14%[3]。随着对虾集约化养殖规模的不断扩大，导致养殖水环境持续恶化、传染性疾病大规模爆发，严重制约对虾养殖业发展[4-5]。相关研究表明，养殖环境的细菌群落组成是影响海洋生物疾病暴发的重要因素[6-7]，弧菌则是水产养殖中细菌性流行病的主要因素[8-10]。因此在养殖过程中检测弧菌、水质变化起着至关重要的作用。

多数养殖企业通过大量换水更新养殖水质，从而解决水质恶化问题，这种模式也称为流水式养殖(flow-through system,FTS)。但在养殖过程中换水可能会引入外来病原，使得对虾获得疾病，同时大量换水会造成严重水资源浪费并且污染周围养殖水域[11-12]。

近年来，相关研究表明对虾循环水养殖系统(re-circulating aquaculture system,RAS)在养殖生产中具有较强的可行性[13]。目前，对虾循环水养殖在水资源消耗、对虾疾病管控等方面具有优势，受到对虾养殖业广泛关注[14-16]，对养殖水体水质具有良好调节效果，方便实施[17-19]。此外，生物滤池作为对虾循环水养殖系统中养殖废水净化处理的核心，具有较好的生物处理效果和较高的硝化效率，为养殖水体水质中的营养物转化提供了有效保证[20]。但这两种系统长期运行的稳定性和细菌群落演替规律异同的报道较少，这些差异是如何影响对虾养殖也是未知的。

本研究对相同养殖容量、相同温度范围和相同水源运行的两种养殖模式进行了比较研究，分别在养殖前期、中期和后期对两种养殖系统中水样进行采集，通过分析两种养殖系统中的水质、弧菌总数和细菌总数变化、水体中细菌群落变化、可培养菌株情况等数据，系统性地比较流水式和循环水两种对虾养殖模式的系统稳定性及其对细菌种群演替的影响。

1 材料与方法

1.1 试验系统与样品采集

本试验于2020年5月—2020年10月对营口某养殖场中流水式和循环水对虾养殖系统中的水样进行采集，养殖周期均为100 d。每套系统由规格相同的养殖池组成，养殖池规格均为1.5 m×1.5 m×1.5 m，水深1.0 m，水体2.25 m3。采用气泵曝气充氧。其中循环水养殖系统还配备了生物滤器(0.45 m×0.3 m×0.7 m)用于水质处理。生物滤器内填充生物填料，生物滤器内生物膜处于成熟状态。循环水养殖池采用2 000 L/h循环泵，24 h运行。

流水式养殖系统(FTS)和循环水养殖系统(RAS)每日换水率分别为20%和0.5%，养殖水体水温(T)24～27 ℃，溶氧7～8 mg/L，pH 7.8～8.5。对虾养殖前平均体长77 ±7.37 mm，平均体质量2.8 ±0.91 g。每个养殖池放虾苗100尾，放养密度为0.124 kg/m3。养殖期间，每天投喂3次，投喂时间分别为7∶00、12∶00、19∶00。投喂饲料选自唐山禾丰科技有限公司，日投喂量为虾体生物量的5%，通过观察养殖桶内残余饲料及粪便量多少，适当调节饲料投喂量。

试验分为2组，一组为高盐度组(A组)，使用海水和自来水配制，盐度为8。另一组为低盐度组(B组)，直接使用地下井水作为水源，盐度为4。每组包含4个养殖池，流水式养殖系统和循环水养殖系统各使用2个养殖池(图1)。

图1 流水式养殖模式(FTS)和循环水养殖模式(RAS)养殖池示意图

在养殖第1天，第50天，第100天(分别对应养殖前期，中期和后期)对养殖系统水样进行采集测序，每14 d采集一次水样，检测弧菌总数和细菌总数，同时每25 d采集一次水样，检测水质参数。

1.2 水质测定方法

分别从同一养殖系统2个养殖池内水深0.75 m处取0.5 L水样混匀，检测水质氨氮、亚硝酸盐氮和COD指标，测定方法参照海洋监测规范GB17378.7—2007[21]。其中，采用次溴酸盐氧化法测定氨氮数值，采用萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐氮，采用碱性高锰酸钾法测定COD数值[21]。

1.3 养殖水体弧菌和细菌计数

取养殖水体25 mL加入225 mL生理盐水中混匀，随后采用10倍系列梯度稀释液分别涂布于TCBS琼脂培养基和2216E琼脂培养基平板内，每个稀释梯度设置3个平行，37℃培养24 h后进行细菌总数和弧菌总数计数[22]。

1.4 DNA提取和高通量测序

使用直径为47 mm，孔径0.22 μm的滤膜对水体进行过滤。用剪刀将整张过滤膜尽量剪碎，置于2 mL离心管中。

采用Water DNA Isolation Kit试剂盒(FOREGEN)提取的养殖水体总基因组DNA，委托诺禾致源有限公司进行16S rDNA V4区高通量测序。基于 Illumina HiSeq 测序平台，以双末端测序(Paired-End)进行小片段文库的构建，构建后对文库进行测序，每个样品重复两次。在对原始测序序列进行过滤、双端拼接后得到优化序列。利用软件QIIME(version 1.8.0)[23]中的UCLUST将优化序列进行聚类，进而进行操作分类单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)的划分，并根据OTU的序列组成获得养殖水体样本中细菌的物种分类。在OTU结果的基础上对样品进行分类学分析，获得养殖水体细菌的群落结构图。Alpha多样性分析研究97%以上相似度水平下的Ace、Chao1及Shannon指数，对养殖水体细菌群落多样性进行分析。同时运用主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)对养殖水体细菌群落的差异性进行分析。

1.5 数据处理

数据均利用Excel 2010和SPSS19软件进行处理和统计分析。

1.6 细菌分离与鉴定

采用2216E 海水培养基分别对循环水和流水式养殖池水体进行细菌分离与鉴定，在养殖第14、28、42、56、70、84、100天进行取样分离。随后利用细菌基因组DNA提取试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。采用16S rRNA 引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对其进行PCR扩增[24]。PCR反应体系为：DNA模板2.5 μL；上下游引物F/R各0.5 μL；2×Taq PCR Super Mix12.5 μL；ddH2O 9 μL。PCR产物送至北京华大基因科技有限公司，完成测序。

2 结果

2.1 对虾养殖期间生长情况

养殖后期，FTS中高盐组和低盐组的对虾平均体质量从2.8 ±0.91 g分别增加至10.9 ±4.08 g和8.6 ±3.22 g，平均体长从77.6 ±7.37 mm增加至117.4 ±13.99 mm和106.9 ±14.11 mm。

RAS中高盐组和低盐组的对虾平均体质量从2.8 ±0.91 g分别增加至10.5 ±1.73 g和11.1±4.67 g，平均体长从77.6 ±7.37 mm分别增加至116.8 ±4.78 mm和119.3 ±15.35 mm。结果显示，FTS和RAS中的对虾体质量无显著性差异(P>0.05)(图2)。

图2 对虾养殖期间平均体质量(A)和平均体长(B)变化

2.2 养殖水体中水质参数变化

2.2.1 养殖水体中COD质量浓度变化

RAS和FTS养殖池水体中COD质量浓度变化如图3A所示，高盐组和低盐组中FTS水体中COD质量浓度均高于RAS水体。高盐组RAS水体中COD质量浓度在养殖第25天时略显升高，但后期COD质量浓度变化基本趋于稳定，变化范围为2.32～4.00 mg/L。高盐度FTS水体中COD质量浓度变化范围为2.56～8.98 mg/L，随着养殖时间的增加，FTS水体中COD质量浓度逐渐增加，且均高于RAS水体质量浓度，养殖后期质量浓度差异显著。

同样低盐组RAS水体中COD质量浓度在养殖前期小幅度增加，养殖中后期COD质量浓度基本稳定，变化范围为2.59～4.50 mg/L。低盐组FTS水体中的COD质量浓度变化与高盐组变化趋势基本相同，呈大幅度增加趋势，且明显高于RAS水体中COD质量浓度，变化范围为2.86～9.62 mg/L，同样养殖后期浓度差异显著。

2.2.2 养殖水体中氨氮质量浓度变化

RAS和FTS养殖池水体中氨氮质量浓度变化如图3B所示，高盐组和低盐组中FTS水体中氨氮质量浓度均高于RAS水体。高盐组RAS水体的氨氮质量浓度变化范围为0.020～0.093 mg/L，其氨氮质量浓度在养殖前期略显升高，但在养殖中后期氨氮质量浓度基本趋于稳定。FTS水体的氨氮质量浓度变化范围为0.020～0.268 mg/L，随着养殖时间的增加，FTS水体中氨氮质量浓度显著增加，且均高于RAS水体中氨氮质量浓度，养殖后期质量浓度差异显著。

低盐组RAS水体中氨氮质量浓度在养殖前期小幅度增加，养殖中后期氨氮质量浓度基本稳定，变化范围为0.003～0.102 mg/L。低盐组FTS水体中氨氮质量浓度呈大幅度增加趋势，且明显高于RAS水体中氨氮质量浓度，变化范围为0.025～0.305 mg/L，同样养殖后期质量浓度差异显著。

2.2.3 养殖水体中亚硝酸盐氮质量浓度变化

RAS和FTS养殖池水体中亚硝酸盐氮质量浓度变化如图3C所示，高盐组和低盐组中FTS水体中亚硝酸盐氮质量浓度均高于RAS水体。高盐组RAS水体的亚硝酸盐氮质量浓度变化范围为0.001 2～0.012 5 mg/L，其亚硝酸盐氮质量浓度在养殖前期略显升高，但在养殖第25天后亚硝酸盐氮质量浓度基本趋于稳定。FTS水体的亚硝酸盐氮质量浓度变化范围为0.001 6～0.053 6 mg/L，随着养殖时间的增加，FTS水体中亚硝酸盐氮质量浓度显著增加，且均高于RAS水体中亚硝酸盐氮质量浓度，养殖后期质量浓度差异较大。

图3 循环水和流水式养殖系统养殖水体中COD(A)、氨氮(B)和亚硝酸盐氮(C)变化

低盐组RAS水体中亚硝酸盐氮质量浓度在养殖前期小幅度增加，养殖中后期亚硝酸盐氮质量浓度略微升高，变化范围为0.000 1～0.015 0 mg/L。低盐组FTS水体中亚硝酸盐氮质量浓度呈大幅度增加趋势，且明显高于RAS水体中亚硝酸盐氮质量浓度，变化范围为0.000 7～0.078 0 mg/L，同样养殖后期质量浓度差异较大。

2.3 养殖水体中弧菌总数和细菌总数变化

图4A显示，随着时间增加，两种养殖系统水体中弧菌总数在初始时明显较低，随后持续增加。FTS和RAS水体中弧菌总数变化差异显著(P<0.05)。FTS水体中弧菌总数明显高于RAS，同时FTS水体中弧菌增长速率高于RAS。

RAS内弧菌总数在0～28 d内保持平稳，28 d后呈增长趋势，变化范围为1.13×102～1.01×103CFU/mL；FTS内弧菌总数随时间增加在0～70 d呈明显上升趋势，弧菌总数最高达到4.73×103CFU/mL，随着养殖时间的增加，FTS内弧菌总数增长速率高于RAS，且弧菌总数明显高于RAS，在养殖中后期差异明显，在养殖第70天，两种养殖模式弧菌总数最大相差4.08×103CFU/mL。

图4B显示，随着时间增加，两种养殖系统下细菌总数在初始时明显较低，随后持续增加。FTA和RAS水体中细菌总数变化差异显著(P<0.05)。FTS水体中细菌总数明显高于RAS，同时FTS水体中细菌增长速率RAS。

图4 高盐组(A)和低盐组(B)养殖水体中弧菌总数、细菌总数变化

RAS在0～28 d细菌总数变化趋于平稳，28d以后细菌总数明显增加，最高达到3.04×104CFU/mL。RAS水体中内细菌总数变化较小，范围在4.34×102～3.82×103CFU/mL之间。随着养殖时间的增加，FTS水体中细菌总数增长速率高于RAS，且细菌总数明显高于RAS系统，在养殖第70天，细菌总数最大相差2.92×104CFU/mL。

2.4 高盐组流水式和循环水养殖系统细菌群落组成分析

对养殖水体各采样点提取的水体DNA，选择16S rDNA V4区域进行扩增子测序，高盐度和低盐度2套流水式养殖系统分别标记为FTS-A和FTS-B，3个采样时间对应的水体分别标记为FTSA1、FTSA50和FTSA100；高盐度和低盐度2套循环水养殖池分别标记为RAS-A和RAS-B，3个采样时间的水体分别标记为RASA1、RASA50和RASA100。样品的覆盖率(Good’s coverage)指数均超过99.9%(表1)，说明本试验测序深度足够大，足以覆盖样品的大多数微生物，测序的数据量合理[25]。

表1 样品的细菌群落多样性

图5A结果显示，高盐组流水式养殖系统(FTSA)水体中主要分布变形菌纲(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和Campilobacteroa。FTSA水体中变形菌纲所占比例随着养殖时间的增加不断升高，水体中Campilobacteroa所占比例随着养殖时间的推移逐渐减少；高盐组循环水养殖系统(RASA)水体中变形菌纲所占比例在第50天时略有减少，但在第100天时显著增加。两池相比较而言，养殖池FTSA水体中变形菌纲所占总细菌量的比例高于池RASA，循环水养殖系统的变形菌纲(Proteobacteria)种群演替速度慢于流水式养殖系统。

图5B属水平结果显示，在高盐组养殖池FTSA养殖水体中，弧菌属(Vibrio)为主要优势菌。RASA养殖水体中黄杆菌属(Flavobacterium)和红细菌科(Rhodobacteraceae)为优势菌。养殖池FTSA和养殖池RASA养殖水体中细菌组成结构存在一定差异，在所采集的养殖水体中，养殖池FTSA水体中弧菌属所占细菌总数比例随时间的推移迅速升高，早期所占细菌总比例3.3%，养殖后期所占比例高达85.3%。池RASA养殖水体中弧菌属比例较少。两池相比较而言，养殖池FTSA水体中弧菌属所占细菌总量比例均显著高于养殖池RASA。

注：高盐组流水式和循环水养殖系统门(Phylum)水平(图A)和属水平(图B)水体细菌群落结构组成

2.5 低盐组流水式和循环水养殖系统细菌群落组成分析

图6A结果显示低盐组流水式养殖系统(FTSB)水体中主要分布着变形菌纲(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)两大类细菌。养殖池FTSB养殖水体中变形菌纲所占比例随着养殖时间的增加不断减少，水体中Epsilobacteraeota所占比例随着养殖时间的推移逐渐增加；而低盐组循环水养殖池(RASB)水体中变形菌纲所占比例在第50天时升高，在第100天时有所降低，但高于第1天所占比例，同样养殖水体中Epsilobacteraeota在第100天时显著增加。经两组养殖系统结果分析，两种养殖系统养殖水体中变形菌纲(Proteobacteria)为水体优势细菌。

图6B同样可以看出，在属水平，低盐组养殖池FTSB养殖水体中弧菌属(Vibrio)为优势菌，而循环水养殖池RASB水体优势菌为红细菌科(Rhodobacteraceae)、交替单胞菌属(Alteromonas)和弧菌属。

注：低盐组流水式和循环水养殖系统门(Phylum)水平(图A)和属水平(图B)水体细菌群落结构组成

两池养殖水体细菌组成结构差异与组一基本相同，养殖池FTSB养殖水体中弧菌属所占细菌总数比例随时间的推移迅速升高。养殖池RASB养殖水体中弧菌属所占比例在试验第1天和第50天时均比较小，在第100天时迅速升高。两池相比较而言，养殖池FTSB水体中弧菌属所占细菌总量比例均显著高于养殖池RASB。两组试验数据结果基本相同，两池养殖水体中弧菌占细菌总数量的比例均随养殖时间的增加而升高，但养殖池FTSB水体中弧菌数量和增长速度均高于养殖池RASB。

2.6 养殖水体细菌群落多样性分析

对养殖水体细菌群落的Alpha多样性(Alpha diversity)进行分析，反映养殖水体细菌群落物种丰度及多样性。

结果显示：试验第1天，RAS与FTS水体中细菌种群Chao1指数、ACE指数和Shannon指数均基本相同，表明试验起始养殖水体细菌群落丰富及多样性基本相同。试验第50天，高盐组与低盐组FTS水体细菌种群Chao1指数和ACE指数均高于对应的RAS，表明在养殖中期，FTS水体中细菌群落丰富度与多样性高于RAS。高盐组在养殖第100天时，RAS水体中ACE指数和Chao1指数、Shannon指数均有所升高，低盐组则少量降低；FTS水体中ACE指数和Chao1指数、Shannon指数与第1天数值基本无显著变化；RAS水体中细菌群落的多样性高于FTS，其中对于RAS,Chao1指数的均值是1 136.189 3，而对于FTS是1 050.823 9。

2.7 养殖水体细菌群落差异性分析

随后，为了进一步解析两种养殖模式水体细菌群落的差异性，对循环水养殖池和流水式养殖池养殖水体细菌群落的测序结果进行主坐标分析(PCoA,Principal Co-ordinates Analysis)。

图7A中PC1和PC2解释了高盐组养殖水体中细菌群落 54.47%和 23.92%的信息，两主成分之和为78.39%，可以较好地代表样品中的细菌群落信息。分析结果显示：养殖期间3次采样FTS与RAS距离均较远，即表明FTS和RAS水体的细菌群落组成均存在较大差异。

图7B中PC1和PC2解释了低盐组养殖水体中细菌群落 66.03%和 26.45%的信息，两主成分之和大于90%，也较好地代表样品中的细菌群落信息。分析结果显示：在试验第1天与试验第50天，两种养殖系统距离较近，但在试验第100天时两种养殖系统距离较远，表明在养殖前期两种养殖水体的物种组成结构越相似，细菌群落组成差异较小，但随着养殖时间的增加，养殖水体细菌群落组成产生较大差异。

图7 高盐组(图A)和低盐组(图B)养殖水体细菌群落主坐标分析(PCoA)

综上结果表明：随着养殖时间的增加，FTS与RAS内的细菌群落差异逐渐产生明显较大差异，细菌组成结构逐渐不同。

2.8 养殖水体可培养菌株分析

对高盐组和低盐组FTS养殖水体中可培养细菌进行培养，共分离59株菌株，由图8A可知可培养细菌中弧菌(Vibrio)所占比例达到61%，为可培养细菌的优势类群，芽孢杆菌(Bacillus)所占比例为12%，其次为不动杆菌(Acinetobacter)、发光细菌(Photobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Enterobacter)、希瓦菌属(Shewanella)，所占比例分别为7%、5%、3%、3%和3%。

对高盐组和低盐组RAS养殖水体中可培养细菌进行培养，共分离出34株菌株，由图8B可知可培养细菌中肠杆菌(Enterobacter)所占比为18%，气单胞菌(Aeromonas)、Klebsiella、弧菌(Vibrio)、海洋杆菌(Marinobacterium)所占比例均为9%。两种养殖系统中共培养可培养菌株93株，其中弧菌属(Vibrio)为主要可培养菌株，所占比例为所有可培养菌株的41.9%，其次为肠杆菌(Enterobacter)和芽孢杆菌(Bacillus)，占比均为8.6%。

图8 流水式养殖水体(图A)和循环水养殖水体(图B)可培养细菌饼状图

3 讨论

3.1 两种养殖系统水质参数及弧菌、细菌总数比较

本研究通过对循环水对虾养殖系统和流水式养殖系统全过程中水质、弧菌总数和微生物种群结构进行了系统性分析。对虾生长情况方面，FTS和RAS中的对虾体质量无显著性差异(P>0.05)，这与张龙等[13]结果一致。水质方面，初始时FTS和RAS水体中氨氮、亚硝酸盐氮和COD质量浓度较低，随着养殖时间增加，三者质量浓度逐渐升高，养殖后期FTS水体中氨氮、亚硝酸盐氮和COD质量浓度明显高于RAS，与索建杰等[1]、RAT等[26]结果一致。弧菌总数和细菌总数方面，两种养殖模式下弧菌总数和细菌在初始时明显较低，随后弧菌和细菌总数持续增加。FTS下水体中弧菌总数和细菌总数明显高于RAS，同时FTS水体中弧菌和细菌总数增长速率高于RAS。

3.2 两种养殖系统细菌群落组成比较

门水平分析显示变形菌纲(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为水体优势细菌。属水平主要为弧菌属(Vibrio)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、交替单胞菌属(Alteromonas)等。最后本研究对两种系统的可培养菌株进行了比较，在两种养殖系统中得到可培养菌株93株，其中FTS水体中弧菌属(Vibrio)为主要可培养菌株，所占比例为61%。而循环水系统肠杆菌(Enterobacter)所占比例为18%，为主要可培养菌株，通过可培养菌株可以看出FTS养殖水体中提高致病性的弧菌明显高于RAS，从而降低系统稳定性。结果显示在FST和RAS两种对虾养殖模式中，在水体细菌群落种群结构的稳定性方面，循环水养殖系统优于流水式养殖系统。

Heyse等[27]初步研究了不同操作对凡纳滨对虾幼虾阶段微生物种群结构的影响。通过对干饲料、轮虫、藻类加入水体前后及换水前后微生物种群动态变化进行18 d监测，结果显示藻类和轮虫为系统提供了新的细菌种群，其中有很大一部分有潜在病原菌，对病害发展进程影响最大，而水体交换前后，微生物种群动态变化并不显著，并被认为不是引入病害的主要原因[27]。本研究结果发现，在饲料等条件一致的情况下，FTS中的细菌群落稳定性相比RAS较差，说明换水会对养殖系统水体细菌群落稳定性造成一定的影响，这与Heyse等[27]结果不同，可能是本试验与其相比进行了100 d的长期观测，增加养殖周期从而观察出对试验的影响。

本结果表明，随着时间的推移，循环水养殖系统中的微生物种群比流水式养殖下的微生物种群更稳定，这与Vadstein等[28]提出的假设一致。最近的一项研究通过变性梯度凝胶电泳(PCR/DGGE)分析了16S rDNA基因序列，以比较一个流水式养殖系统和一个循环水养殖系统养殖水体和大西洋鳕鱼幼虫的细菌群落组成[29]。基于Bray-Curtis相似性的排序表明，循环水养殖系统样本之间没有明显的分离；然而，在流水式养殖样品中微生物群落组成发现了明显的分离。此外，循环水养殖系统中的Bray-Curtis相似性为75%，而流水式养殖中为20%～25%，这表明循环水养殖系统中的细菌群落更加稳定。所有这些观察结果都支持关于稳定水质参数将对微生物群落演替特征产生重要影响的微生物管理假说。

此外，本研究通过扩增子测序还发现，与传统换水养殖模式相比，循环水养殖系统在一个对虾养殖周期内对弧菌的控制效果更好。这与之前的研究相符。例如杨胜远等[30]采用TCBS琼脂平板菌落计数法对凡纳滨对虾循环水养殖系统水体中弧菌的消长进行了监测。结果表明，与传统换水养殖模式相比，循环水养殖系统对非O1群霍乱弧菌,溶藻弧菌和普通变形杆菌控制效果更好。在整个养殖过程中，循环水养殖系统弧菌和普通变形杆菌的数量均低于对虾发病的阈值(104CFU/mL)[30-31]。这也很好地说明了循环水养殖系统中可以更好地减少病害的发生，以提高养殖效率及产量。