麦冬和青绿薹草对土壤苯并[a]芘的去除率及叶片生理响应特征

张灵巧，朱梦婷，彭 颖，宋林姝，刘 燕*

(1北京林业大学 园林学院，北京 100083；2花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室，北京 100083；3国家花卉工程技术研究中心，北京 100083；4城乡生态环境北京实验室，北京 100083)

苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，BaP)在环境中分布广泛，性质稳定，是国内外环境监测的重要指标之一[1]，也是美国环保局(EPA)公布的优先监测的16种多环芳烃中的一种，是致癌性最强的物质之一[2]。研究表明暴露在苯并[a]芘中会对动物造成各种伤害，引起机体的氧化应激作用，还会影响细胞周期，对DNA造成损伤，同时干扰动物的内分泌[3]。环境中的苯并[a]芘大多数存在于地表土壤中[4]，生物合成、自然起火和火山活动构成了苯并[a]芘的天然本底值，人类活动是造成苯并[a]芘污染的主要原因[5]。

国内外文献均报道人居环境土壤中含有不同浓度的苯并[a]芘。波兰克拉科夫(Cracow)各交通干线及钢铁厂周围土壤中含有苯并[a]芘等多环芳烃，其浓度高达0.8 mg/kg[6]；日本大阪市区土壤中苯并[a]芘含量达1.190～4.930 mg/kg，高于郊区约100倍[7]；立陶宛的维尔纽斯市(Vilnius)大气沉降物中每年都有苯并[a]芘的积累[8]。中国河北省的土壤苯并[a]芘含量最大值为0.298 mg/kg，其污染以钢铁工业发达的城市及其附近的区域为核心[9]；西安、广州、深圳、广州等8个城市污泥及土壤中的苯并[a]芘平均含量为1.69 mg/kg[10]；上海市部分土壤中苯并[a]芘含量高达0.73 mg/kg[11]；乌鲁木齐污灌区农田土壤中苯并[a]芘平均含量为0.92 mg/kg[12]。北京市3个带状公园绿地土壤样品中含量最高的多环芳烃是苯并[a]芘，浓度为0.6 mg/kg左右[13]；北京市区公园绿地和居住区绿地表层土壤样品普遍受到多环芳烃的污染，其中苯并[a]芘的贡献率在10%以上，平均浓度达0.58 mg/kg，且随年份推移，污染程度呈增加趋势[14]；根据建设用地土壤污染风险管控标准GB36600-2018[15]，北京地区园林绿地土壤中的苯并[a]芘浓度达到了第一类用地的土壤筛选值0.55 mg/kg，存在一定的风险。

植物可以从土壤中吸收苯并[a]芘等多种多环芳烃，但会对植物的生长造成伤害[16-18]。研究显示，不同浓度的多环芳烃对植物的生长会造成不同的影响[4,19-22]，但目前主要集中在对菲、芘等多环芳烃的研究，而对于多环芳烃中致癌性最强且分布广泛的苯并[a]芘研究尚不够重视，对清除苯并[a]芘的植物选择研究较少，仅见黑麦草、地毯草、白三叶、苏丹草及部分羊茅属草坪草植物的报道[23-26]，其去除机制主要有直接吸收、根部释放分泌物和酶促进其分解、植物强化根际微生物的降解作用等[24,27]。因此，选择更多可以清除土壤苯并[a]芘的植物种类用于环境绿化建设有重要意义。

麦冬(Ophiopogonjaponicus)和青绿薹草(Carexbreviculmis)是北京绿地中的常绿地被植物，有一定耐阴性，可在北京露地越冬[28-32]，本研究旨在考察这两种园林植物对土壤不同浓度苯并[a]芘的耐受性、去除率及其在苯并[a]芘胁迫下叶片的生理变化，为今后选择可清除土壤有机污染的园林植物提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料与试验设计

供试植物麦冬(O.japonicus)和青绿薹草(C.breviculmis)为2年生的工程苗，购自北京绿普方圆花卉科技有限公司。试验用盆栽土源自北京林业大学实习圃三顷园的园土(褐色砂壤土)，其苯并[a]芘的背景值为0.0302 mg/kg，有机质含量为19.29 g/kg，有效磷为5.95 mg/kg，速效钾为271.33 mg/kg，水解氮为125.9 mg/kg。用于土壤污染处理的苯并[a]芘购于上海迈瑞尔化学技术有限公司，纯度>96%。

中华人民共和国环境保护部发布的《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准(试行) (GB36600-2018)》[15]规定，第一类用地(包含公园绿地中的社区公园和儿童公园用地等)和第二类用地(包含绿地及广场用地等)土壤苯并[a]芘浓度的筛选值分别为0.55和1.5 mg/kg，管制值分别为5.5和15 mg/kg。其中，筛选值是指污染物含量等于或低于该值的，对人体健康的风险可以忽略，超过该值后对人体健康可能存在风险；管制值是指污染物含量超过该值的，对人体健康通常存在不可接受的风险，应当采取风险管控或修复措施。依据以上规定，本试验设置4个土壤苯并[a]芘浓度：即园土背景值(对照，CK)、5.5 mg/kg(T1)、15 mg/kg(T2)、30 mg/kg(T3)。污染土壤具体制备参考刘世亮等[23]方法：首先称量出每个处理所需的供试土壤，根据所需要土壤的污染浓度分别计算所需苯并[a]芘的量，先用丙酮溶解所需的苯并[a]芘，加到上述所称的少部分供试土壤中，待1～2 d丙酮挥发后，再将它们拌入全部供试土壤中，充分混匀，获得所需的不同苯并[a]芘污染浓度土壤。1周后用于种植植物。

试验于2020年1月15日-4月15日在北京林业大学林业科技股份有限公司试验基地(40°01′61″N，116°35′19″E)进行，为避免空气成分干扰，于温室(温度15 ℃，湿度40%左右，自然光照)中进行。定植前采集园土样品，测定苯并[a]芘浓度，作为对照组(CK)背景值。采用80 cm×40 cm塑料容器，装入不同苯并[a]芘浓度的土壤，1月15日在苗圃选取大小一致的植株种植并移入温室。每个容器定植12株，设置3个重复，即每个处理共36株植物。4月15日采收植物，测量株高、根长及干重，并测定叶片的生理指标和采收后土壤苯并[a]芘浓度。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 株高、根长和干重将整株植物从土壤中取出，用自来水初步冲洗干净，用直尺测量株高及根长。株高为植物根颈至叶片最高部位的距离；根长为植物根颈至根系最长部位的距离。用去离子水进一步冲洗整株植物后，于烘箱内烘干至恒重，称重后得到植株干重。

1.2.2 土壤中苯并[a]芘含量采用中华人民共和国国家环境保护标准HJ784-2016[33]土壤和沉积物多环芳烃的测定-高效液相色谱法测定，并作一定调整[13]。采用超声波提取法进行样品的提取，而后使用柱层析净化法，采取硅胶层析柱进行净化，使用液相色谱仪测定。色谱柱为PAH色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)；柱温为25 ℃；流动相为水/乙腈，梯度洗脱条件为V(水)∶V(乙腈)初始值为60∶40，0.66 min后比值为60∶40，20 min后降至0∶100，27 min后升至60∶40，30 min后结束。流动相流速为2 mL/min，进样量为10 μL。检测器为可变波长紫外检测器，监测波长为290 nm。采用方法空白、空白加标、基质加标、平行样品进行质量控制。苯并[a]芘的检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg，最终的结果经过回收率校正。

土壤中苯并[a]芘的降低值以及去除率的计算方式如下：

苯并[a]芘降低值=土壤苯并[a]芘污染浓度-植物采收后土壤苯并[a]芘浓度；

去除率=苯并[a]芘降低值/土壤苯并[a]芘污染浓度×100%。

1.2.3 叶片光合色素含量参照Ma等[34]的方法，取新鲜植物叶片0.1 g，将叶片剪碎后浸没在3 mL 95%乙醇中48 h，至叶片完全变成白色。8 000 r/min离心5 min后,取上清液测定其在665、649及470 nm下的吸光度，计算总叶绿素及类胡萝卜素的含量。

1.2.4 叶片丙二醛含量采用2-硫代巴比妥酸(TBA)显色法[35]。取叶片0.1 g，放入预冷的研钵中，分两次加入1 mL三氯乙酸在冰上研磨，至匀浆后倒入2 mL离心管中。4 ℃、10 000 g 离心 15 min，取上清液用于测定组织中 MDA 的含量。取2 mL离心管依次加入 0.8 mL上清液、0.8 mL 0.67% 的TBA，混匀后，将扎好孔的离心管放入恒温水浴锅中100 ℃煮15 min，随后取出置于冰上冷却10 min。再次10 000 g 离心 5 min，取出后用紫外分光光度计测定在波长450、532及600 nm 处的吸光度值，据此计算 MDA含量。

1.2.5 叶片过氧化氢(H2O2)和羟自由基(-OH)含量取叶片0.3 g，分两次加入双蒸水共1.5 mL，在冰上研磨至匀浆后倒入2 mL 离心管中，4 ℃、10 000 g离心15 min，取上清液。分别采用南京建成过氧化氢试剂盒A064-1-1和羟自由基测定试剂盒A018-1-1进行测定，后续步骤具体参照试剂盒说明书。

1.2.6 叶片抗氧化酶活性取叶片0.1 g，分两次加入0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)，在冰上研磨至匀浆，定容到10 mL后倒入离心管，在 4 ℃下10 000 g离心15 min，取上清液作为待测粗酶液。

(1)过氧化氢酶(CAT)活性：采用改进后的紫外分光光度法测定[36]。在5 mL离心管中加入200 μL粗酶液、1.5 mL pH 7.0磷酸缓冲液和1.0 mL蒸馏水；涡旋混匀，置于冰上，加入300 μL 0.1 mol/L过氧化氢溶液，迅速倒入石英比色杯中混匀，以磷酸缓冲液提取液为对照，用紫外分光光度计测定240 nm处的吸光度值；立即开始计时，每隔30 s读数1次，共测 3 min，以此计算过氧化氢酶活性。

(2)过氧化物酶(POD)活性：采用愈创木酚法[35]测定。在试管中依次加入2.9 mL的0.05 mol/L磷酸缓冲液、1 mL 2% H2O2、1 mL 0.05 mol/L愈创木酚溶液和0.1 mL粗酶液；用95 ℃的水浴锅煮沸5 min的粗酶液作为对照；在加了上述试剂的试管中加入粗酶液后，立即于37 ℃水浴中保温15 min，然后迅速转入冰浴中，并加入2 mL的20%三氯乙酸终止反应；然后5 000 g离心10 min，在470 nm波长下测定其吸光度，每1 min读一次值，共读3次，以此计算过氧化物酶活性。

(3)过氧化物歧化酶(SOD)活性：采用氮蓝四唑 (NBT) 法[35]测定。取5 mL指形管若干支，2支为对照管，其他为测定管；依次加入0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)1.5 mL、130 mmol/L的甲硫氨酸溶液0.3 mL、750 μmol/L氮蓝四唑溶液0.3 mL、100 μmol/L EDTA-Na2溶液0.3 mL、20 μmol/L核黄素溶液0.3 mL、上清粗酶液0.05 mL(2支对照管以缓冲液代替上清液)、蒸馏水0.25 mL，混匀，此过程在避光条件下进行。混匀后将其中一支对照管放置于黑暗中，其他各管放置于4 000 Lx灯下反应10 min，最后放置于暗盒终止反应。至反应结束后，以不照光的对照管作为空白，用紫外分光光度计迅速测定560 nm处的吸光度值。

1.3 数据处理

用Excel 2019和SPSS Statistics 25.0进行基础数据分析，并使用Excel 2019进行图表绘制。采用常规单因素(one-way ANOVA)和邓肯(Duncan)法进行方差分析和多重比较(α=0.05)。图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 麦冬和青绿薹草对土壤中不同浓度苯并[a]芘的耐受性

两种植物在不同浓度苯并[a]芘土壤中生长3个月后均全部成活，且从外观看，其叶色、株型等形态与对照组差异不明显，均可保持其观赏价值(图1)。植物受伤害程度和耐受性的相关生长指标(表1)显示，两种植物的株高、根长及生物量受土壤苯并[a]芘的影响不尽相同。其中，随着土壤中苯并[a]芘浓度升高，两种植物的株高、根长以及干重总体呈现降低的趋势，但麦冬仅株高在T3(30 mg/kg)下与CK组差异显著，其他指标各污染浓度处理均与CK组差异不显著；而青绿薹草株高和干重在各污染浓度下均显著低于CK组，明显受到苯并[a]芘的抑制，但各浓度之间差异不显著。以上结果表明虽然苯并[a]芘处理下两种植物生长受到一定影响，但麦冬和青绿薹草均可以耐受土壤中30 mg/kg苯并[a]芘的胁迫，并保持良好的景观效果，但麦冬对苯并[a]芘的耐受性优于青绿薹草。

表1 不同浓度苯并[a]芘土壤中植物生长变化Table 1 Changes of plant growth in soil with different concentrations of BaP

2.2 麦冬和青绿薹草对不同浓度处理土壤中苯并[a]芘的去除效率

麦冬和青绿薹草在不同浓度苯并[a]芘土壤中栽植100 d后，测定土壤中苯并[a]芘含量，与植物种植前进行对比。结果(表2)表明，随着土壤中苯并[a]芘浓度的加大，同种植物对土壤中苯并[a]芘浓度的降低量逐渐加大，且在各处理之间均差异显著。同时，两种植物对苯并[a]芘去除率在各浓度处理与CK组之间均存在显著差异，且随着土壤苯并[a]芘浓度的升高呈现先升高后降低的变化趋势；麦冬的去除率在T1(5.5 mg/kg)时最高(达76.9%)，而青绿薹草的去除率在T2(15 mg/kg)时最高(达79.6%)。可见，植物对土壤中苯并[a]芘的去除率与植物种类和土壤苯并[a]芘浓度有关。

表2 两种植物对不同浓度处理土壤中苯并[a]芘的去除率Table 2 Removal rates of BaP in soil by two plants under different concentration treatments

2.3 土壤中苯并[a]芘浓度对麦冬和青绿薹草叶片光合色素含量的影响

土壤中苯并[a]芘浓度对麦冬和青绿薹草叶片光合色素含量的影响不同(图2)。其中，随着土壤苯并[a]芘浓度增大，麦冬叶片中各类光合色素含量和总含量均呈现先降低后升高的变化趋势，并均在T2(15 mg/kg)时达到最低值，且此时除叶绿素b含量外，均与相应CK组差异显著，而其他两个浓度处理均与CK组差异不显著。与麦冬的表现不同，青绿薹草叶片中各类色素含量随着土壤中苯并[a]芘浓度的增加呈先升高后降低的趋势，并均在浓度T1

(5.5 mg/kg)时最高，但此时仅叶绿素b含量与相应CK组差异显著，其他两个浓度处理各色素含量和总含量均低于CK组，但差异不显著。以上结果说明两种植物色素含量随着土壤苯并芘浓度的变化趋势不同，但仅T2处理麦冬光合色素含量显著降低，以及T1处理青绿薹草叶绿素b含量显著增加。

2.4 土壤苯并[a]芘浓度对麦冬和青绿薹草叶片过氧化氢及羟自由基含量的影响

在不同苯并[a]芘浓度土壤中，两种植物叶片的过氧化氢和羟自由基含量变化不同(图3)。其中，麦冬叶片过氧化氢含量在T1(5.5 mg/kg)处理下比CK组略高，在T2(15 mg/kg)和T3(30 mg/kg)处理时显著高于CK组；青绿薹草叶片过氧化氢含量在T1(5.5 mg/kg)处理时显著低于CK组，在T2处理时显著高于CK组，而在T3(30 mg/kg)处理时与CK组差异不显著。随着土壤苯并[a]芘浓度的升高，麦冬叶片中羟自由基含量先增加后降低，并在T2(15 mg/kg)时最高且显著高于CK组，而其他浓度处理虽高于CK组，但差异不显著；青绿薹草叶片羟自由基含量在各处理浓度下均显著高于CK组，并明显高于相应处理的麦冬。可见，两种植物在土壤不同浓度苯并[a]芘胁迫下活性氧含量的响应不同，但在T2(15 mg/kg)处理时均显著高于相应对照，且青绿薹草积累的活性氧更多。

2.5 土壤苯并[a]芘浓度对麦冬和青绿薹草叶片丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响

图4显示，麦冬和青绿薹草叶片的POD和CAT活性在各土壤苯并[a]芘浓度处理下与对照组相比均无显著变化；两种植物叶片的SOD活性在各浓度苯并[a]芘下基本上比对照组不同程度升高，但仅在麦冬T1(5.5 mg/kg)处理和青绿薹草T3(30 mg/kg)处理时增幅达到显著水平；同时，随着土壤中苯并[a]芘浓度的升高，麦冬叶片丙二醛(MDA)含量与对照组相比无显著变化，并始终处于较低水平；与此同时，青绿薹草叶片中MDA含量却表现出大幅度逐渐上升的趋势，且各浓度处理均显著高于对照组，其中T3(30 mg/kg)处理时最高并显著高于T1(5.5 mg/kg)处理。以上结果表明各浓度土壤苯并[a]芘污染对麦冬叶片的抗氧化酶活性和膜过氧化没有显著影响，耐受性较强；同时也几乎没有诱导青绿薹草叶片抗氧化酶活性显著增强，从而使其受到严重的膜氧化损伤，MDA含量明显高于麦冬，耐受性较弱。

3 讨 论

植物株高、生物量等生长指标的变化是植物受逆境伤害的最直观表现[37]，与植物的逆境耐性相关[38]。不同植物对土壤不同浓度苯并[a]芘有不同的耐受性，即耐受阀值不同，如5种羊茅属植物苇状羊茅、草原羊茅、毛稃羊茅、贫芒羊茅和细芒羊茅的耐受阈值为161.74 mg/kg[25]，浮萍为0.5 mg/kg[39]，油菜‘四月慢’为1.0 mg/kg[40]，结缕草和细羊茅分别为80和40 mg/kg[23]。在阀值内植物生长受到的抑制作用不明显，甚至还能刺激植物的生长，但超过阀值后，植物的生长就会受到显著抑制，这与植物自身的基因型特异性以及生理状态有关。本研究中当土壤苯并[a]芘浓度达到30 mg/kg时，麦冬植株的生长状况受抑制作用不显著，其耐受苯并[a]芘的阀值可能更大，可以继续加大污染浓度，寻找阀值；而青绿薹草在苯并[a]芘为5.5 mg/kg时生长已受到显著抑制，其耐受阀值可能约为5.5 mg/kg。在园林中保持景观效果的前提下，对于可以清除污染的植物种类，研究其污染物耐受阀值具有实际指导意义。

园林植物的种植可以降低土壤苯并[a]芘浓度，改善土壤质量。研究表明不同植物对土壤苯并[a]芘的去除效果不同，李军[26]发现种植3个月后，白三叶对3.5 mg/kg的土壤苯并[a]芘去除效果最好，其次为黑麦草、细羊茅、苏丹草和地毯草；羊茅属的5种植物在土壤苯并[a]芘浓度为10.25～161.74 mg/kg范围内，苇状羊茅去除效果最好，草原羊茅、毛稃羊茅和贫芒羊茅次之，最差的是细芒羊茅[25]。本研究结果显示，麦冬和青绿薹草对苯并[a]芘的去除效果与土壤中苯并[a]芘浓度相关，其中在低浓度(CK和5.5 mg/kg)下麦冬的去除效果优于青绿薹草，而高浓度(15和30 mg/kg)时，青绿薹草的去除效果则优于麦冬。因此评价植物对土壤苯并[a]芘的去除能力时，应该考虑具体土壤苯并[a]芘浓度才具有实践意义。

叶绿素a和叶绿素b以及类胡萝卜素是参与植物光合作用的主要色素，其含量是衡量植物生长状况的重要指标之一[40]。已有研究表明苯并[a]芘对各种植物叶绿素含量的影响不尽相同，如浮萍叶绿素含量随着苯并[a]芘浓度的升高不断降低[41]；油菜叶绿素a和叶绿素b含量则随着苯并[a]芘浓度的升高呈现先增加后降低的趋势[42]。本研究中，随着土壤苯并[a]芘浓度的增加，麦冬叶片光合色素含量呈现先降后升的变化趋势，青绿薹草则表现出先升后降的变化趋势，出现这种情况的原因可能是在苯并[a]芘影响下，叶绿素的合成与降解都会得到增强，但不同植物速率不同，导致两种植物叶片叶绿素含量出现不同的变化趋势[4]。

在逆境胁迫条件下，植物体内会积累过量活性氧，其中起重要作用的是过氧化氢和羟自由基，可以与细胞膜和蛋白质等物质发生化学反应，使膜脂过氧化产生丙二醛(MDA)[43]，造成细胞结构和功能受损[44-45]，对细胞造成不可逆转的伤害[41,46]；而过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是主要的活性氧清除剂[47]，其酶活性会随着活性氧的产生而增强[48]，以减缓膜脂过氧化等伤害发生。本研究显示两种植物的抗氧化酶活性变化均不活跃，其中麦冬低浓度T1(5.5 mg/kg)时SOD活性显著升高，T1处理时CAT活性、T2(15 mg/kg)处理时POD和SOD活性以及T3(30 mg/kg)时POD、SOD、CAT活性均有不同程度升高，但均未达到显著水平；青绿薹草在低浓度T1时3种抗氧化酶活性均降低，T2处理时仅SOD活性升高但差异不显著，仅在较高浓度T3处理时SOD活性显著高于CK组。结合两种植物叶片活性氧变化情况，麦冬叶片在T1处理时羟自由基含量较高，在T2处理时过氧化氢和羟自由基含量均显著高于CK组，在T3处理时过氧化氢含量显著高于CK组；而青绿薹草在各浓度处理下羟自由基含量均显著高于CK组，T2处理时过氧化氢含量显著高于CK组，与羟自由基共同作用。但是，青绿薹草叶片中膜脂过氧化的产物丙二醛含量远高于相应的麦冬，且处理浓度间存在显著性差异，而麦冬叶片中丙二醛含量明显较低且处理间无显著差异，这可能也是麦冬对土壤苯并[a]芘耐受性强的原因。至于麦冬膜脂过氧化程度低可能与其叶片内其他非酶类抗氧化物质发挥了重要作用有关，仍需进一步的探索。

综上所述，本研究结果表明，麦冬和青绿薹草可耐受苯并[a]芘污染浓度低于30 mg/kg的土壤环境，在保持景观效果的前提下，可有效去除土壤中苯并[a]芘；其中土壤苯并[a]芘浓度小于5.5 mg/kg时麦冬的去除效果优于青绿薹草，而高浓度(15～30 mg/kg)时，青绿薹草的去除效果则优于麦冬。麦冬对苯并[a]芘土壤污染的耐受性强于青绿薹草，这与其在各种土壤苯并[a]芘污染浓度下的光合色素含量较稳定、膜质过氧化程度较低等密切相关。