高温胁迫对萝卜幼苗生长及相关基因表达的影响

周 娜，郑 阳，陆景伟，胡 燕，陶伟林，雷开荣，潘晓雪*

(1 重庆市农业科学院 蔬菜花卉研究所, 重庆 401329；2 重庆市农业科学院 生物技术研究所/逆境农业研究重庆市市级重点实验室, 重庆 401329)

萝卜(Raphanussativus. L)属于十字花科萝卜属，是中国广泛栽培的重要根菜类蔬菜[1]。萝卜喜冷凉气候，每年4～10月，大棚内平均温度在30 ℃以上，超过萝卜的耐受程度，导致其生长势减弱，植株根茎增长受到抑制，甚至死亡，严重影响了萝卜的种植范围和上市季节，制约了萝卜的优质生产与均衡供应[2]。因此，通过筛选耐热性较强的萝卜材料，育成优质耐热萝卜新品种是解决生产需求的重要途径。

高温不仅对植物造成明显的外部损伤，还会影响植物体内细胞膜结构、渗透调节机制、抗氧化系统以及光合作用等[3]。植物在长期进化过程中可通过被动的改变来缓解高温热害，如积累大量的可溶性糖和脯氨酸来提高自身的渗透调节能力，从而保证植物体内水分的充足，缓解因高温而加剧的蒸腾作用；还可通过降低叶绿素总含量从而避免产生光氧化现象，保护光合系统免受损伤[4-5]。热胁迫能引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)类物质H2O2的生成，激活热激蛋白(heat shock proteins，HSP)的表达，而热激转录因子(heat shock transcription factors，HSF)能够迅速与HSP启动子的热激元件(heat shock element，HSE)结合，激活下游基因的表达，从而提高植物对高温胁迫的耐受能力[6-7]。

11162-3-1T-1是从重庆地方品种‘中坝萝卜’材料中优选的单株，再连续自交分离选择育成的优良高代自交系，它具有苗期耐热性较强、早熟、配组萝卜品质好且产量高等特点。Wr129A2A1是‘种都2号’杂交一代圆白萝卜品种经多代连续自交分离选择育成的高代自交系，对热敏感，但抗病性强。因此，本研究以耐热性较强的11162-3-1T-1和对热敏感的Wr129A2A1为材料，对比研究高温胁迫对二者幼苗生长、光合作用、细胞膜透性、渗透物质含量和抗氧化活性的影响，以及热激胁迫相关基因在叶片中的表达情况，为萝卜耐热材料创制及新品种选育提供科学依据，同时为萝卜耐高温机理机制解析提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

田间自然高温胁迫试验材料12份，苗期高温胁迫试验材料为筛选出的热敏感材料Wr129A2A1和耐热性较强的材料11162-3-1T-1，其中‘热白50天’由重庆科光种苗有限公司提供，‘糖晶’由重庆方正农业有限公司提供，其余10份材料均由重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所提供(表2)

1.2 田间表型调查

2021年6月18日，12份萝卜材料于国家蔬菜改良中心重庆分中心试验基地播种，1 m开廂双行种植，每份材料种植30株，行距0.50 m，株距 0.40 m，单株栽培，设3次重复，随机区组排列。田间管理同常规大田栽培管理。于播种后1个月调查植株长势，60 d后，田间选取生长一致的10个单株，测量每个单株的最大叶长、最大叶宽、叶重、根长、根粗和根重，同时调查每份材料的越夏死亡率和抗病性。

1.3 萝卜苗期高温胁迫处理

随机选取Wr129A2A1和11162-3-1T-1健康饱满且无病虫害的种子在55～58 ℃热水中浸泡30 min，转入铺有两层滤纸的培养皿中黑暗条件下发芽，温度25～28 ℃，期间保持滤纸湿润。将发芽种子播于装有育苗基质的50孔穴盘中，置于26 ℃人工气候箱内生长(Climacell 222，德国MMM)，光照强度12 000 Lx、光照12 h，空气相对湿度60%～70%。待苗生长至三叶一心时剔除弱苗，选取均匀一致的6株幼苗种植于营养钵中。五叶一心时进行高温处理，处理条件为: 38 ℃热激处理2 h后，26 ℃恢复生长48 h, 然后40 ℃热处理24 h，再置于26 ℃恢复生长1周(先弱光下生长 2 d，然后在正常光照条件下生长5 d)，拍照记录(高温处理只取到24 h，高温处理到48 h时萝卜幼苗已经死亡)。以上每个处理设3个重复。

1.4 叶绿素荧光参数测定

将Wr129A2A1和11162-3-1T-1种子按上述方法培养，五叶一心时放入40 ℃人工气候箱中进行高温处理，分别于处理0、6、24 h后将所测幼苗放入黑暗中适应 30 min，然后剪下已充分展开的功能叶用调制叶绿素荧光成像系统IMAGING-PAM(德国WALZ)测定光合系统Ⅱ的最大光化学量子产量(Fv/Fm)，每个时间点随机选取10株。

1.5 苗期耐热性相关生理生化指标测定

将Wr129A2A1和11162-3-1T-1按上述方法培养至五叶一心时进行40 ℃高温处理，在处理 0、6、24 h后随机选取5株幼苗的地上部分，保存于-80 ℃冰箱内用于测定各项指标，每个处理设3个重复。采用丙酮乙醇混合液法测定叶绿素含量[8]，采用蒽酮法测定可溶性糖含量、茚三酮比色法测定游离脯氨酸(Pro)含量、硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定丙二醛(MDA)含量、硫酸钛光度法测定H2O2含量、氮蓝四唑(NBT) 法测定超氧化物歧化酶(SOD) 活性、紫外吸收法测定抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性[9]，各指标的测定均设置3个重复。

1.6 基因表达量检测

利用Trizol试剂(Invitrogen)参照说明书提取高温胁迫各时间点(0、6、24 h)样品RNA,并按照反转录试剂盒Reverse Transcription system(Promega 公司)进行cDNA的第一链合成。

以 cDNA为模，RsActin为内参[10]，采用定量试剂盒 SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa 公司)的操作步骤在实时荧光定量 PCR 仪(Applied Biosystems 7500，Foster City，USA)上检测候选基因的表达量。qRT-PCR反应条件为：95 ℃、3 min；95 ℃、5 s，58 ℃、30 s，72 ℃、10s，40个循环；60 ℃收集荧光。每个实验3次生物学重复和3次技术重复，基因相对表达量采用ΔΔCT 法计算。所有基因特异引物(表 1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 用于实时定量PCR分析的引物信息Table 1 Gene specific primers used for quantitative RT-PCR analysis

1.7 数据分析

利用 Excel和 OriginPro8 软件进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 试验期间田间气温动态和材料耐热性表现

大田监控的气温数据(图 1)显示，2021年的 7 月20日至 8 月6日,以及 8月16日至8月21日之间均出现了不同时长和时段的田间自然高温天气条件(日均温在 30 ℃以上，且最高温在35 ℃以上持续13 d)，完全达到了萝卜材料热害鉴定条件。

田间观测结果显示，不同萝卜材料在自然高温条件下耐热性表现出显著差异(表2)。在12份供试萝卜材料中，其中3份材料WC19-57，Wr129A2A1和‘糖晶’在越夏栽培期间全部死亡；‘热白50天’、W20-15和W20-13前期植株长势和成熟期肉质根商品率表现较耐热，但抗性较差，越夏死株率超过20%；11162-3-1T-1和‘秋雪’在整个生长期间，植株长势正常，叶色翠绿，表现出较强的耐热性。因此，选取其中热敏感的Wr129A2A1和耐热性较强的11162-3-1T-1进行后续苗期高温胁迫试验研究。

表2 不同类型萝卜材料田间自然高温胁迫下性状表现与耐热性分析Table 2 Analysis on field traits and heat resistance of different radish varieties

2.2 苗期高温对萝卜幼苗生长状况的影响

在40 ℃高温处理24 h并在室温恢复生长7 d后，Wr129A2A1和11162-3-1T-1苗期耐热性强弱的表现差异显著。其中，耐热材料11162-3-1T-1在高温条件下仍然保持绿色(图2)，在室温条件下恢复生长1周后全部成活；热敏感材料Wr129A2A1高温处理24 h后， 幼苗脱水严重，植株萎蔫、干枯变黄、甚至整株枯死，室温下无法恢复。

2.3 高温胁迫对萝卜幼苗叶片最大光化学效率(Fv/Fm)值和叶绿素含量的影响

高温处理后，虽然Wr129A2A1和11162-3-1T-1叶片的总叶绿素含量和Fv/Fm值随着胁迫时间的增加都呈下降趋势，但是11162-3-1T-1叶片中Fv/Fm值和叶绿素含量都明显高于同期的Wr129A2A1(图 3)。其中，在高温胁迫处理6 h后，Wr129A2A1和11162-3-1T-1叶片中Fv/Fm分别下降至0.261和0.547；胁迫24 h后，Wr129A2A1叶片的Fv/Fm几乎为零，而 11162-3-1T-1仍为 0.457(图3，A)，同时11162-3-1T-1叶片中总叶绿素含量约是Wr129A2A1的2倍(图3，B)。这些结果表明耐热材料11162-3-1T-1在高温胁迫下仍能维持较高的光合能力，表现出更强的耐热性。

2.4 高温胁迫对萝卜幼苗叶片可溶性糖和脯氨酸含量的影响

在高温胁迫处理后，Wr129A2A1和11162-3-1T-1叶片中的可溶性糖和脯氨酸含量都呈上升趋势(图4)。其中，11162-3-1T-1叶片的可溶性糖含量在高温胁迫处理6 h后约是Wr129A2A1的1.61倍，在胁迫24 h后约是Wr129A2A1的3.18倍，差异达到极显著水平(图4，A)；与适温处理(0 h)相比，11162-3-1T-1和Wr129A2A1叶片中脯氨酸含量在高温处理24 h后分别增加了46.91%和43.73%，但是两个材料间的脯氨酸含量在高温处理下始终未见明显差异(图4，B)。

2.5 高温胁迫对萝卜幼苗叶片MDA和H2O2含量的影响

高温胁迫处理后，虽然Wr129A2A1和11162-3-1T-1叶片MDA和H2O2含量都呈上升趋势，但是11162-3-1T-1增幅相对较小(图5)。其中，高温胁迫处理24 h后，Wr129A2A1叶片MDA含量是11162-3-1T-1的1.29倍，差异达到显著水平(图5，A)。11162-3-1T-1叶片H2O2含量在胁迫处理6 h后迅速增加，是Wr129A2A1的1.58倍，两者无显著差异；随后，两者叶片H2O2含量均继续增加，Wr129A2A1的上升幅度更大，在胁迫处理24 h后是11162-3-1T-1的1.56倍，差异达到极显著水平 (图5，B)。

2.6 高温胁迫对萝卜叶片抗氧化酶SOD和APX活性的影响

在40 ℃ 高温处理24 h后，11162-3-1T-1 叶片SOD活性迅速从146.74 U/g上升至2 141.18 U/g，大幅度增加了13.59倍，是同期Wr129A2A1的2.51倍，差异达到显著水平(图6，A)。同时，Wr129A2A1叶片APX活性在高温处理后未见明显变化，而11162-3-1T-1叶片中的APX活性在高温处理6 h后是同期Wr129A2A1的1.64倍，差异达到极显著水平(图6，B)。

2.7 高温胁迫对萝卜胁迫相关基因表达的影响

研究表明，HsfA2作为植物细胞热激信号转导的关键组分，它的表达水平与热激胁迫诱导的AtHSP101、AtHsa32、sHSP-CI、APX2和SUS的表达水平密切相关[11]。为了确定萝卜HsfA2基因在热胁迫下的潜在作用，利用qRT-PCR技术分析了两个不同耐热性材料中RsHsfA2、RsHSP101、RsHsa32、RsHSP25.3、RsHSP18.2-CI、RsAPX2、RsSUS1和RsGolS1在高温胁迫下的转录表达水平(图7)。其中，两个材料的RsHsfA2、RsHsa32、RsHSP18.2-CI和RsGolS1基因在高温胁迫下持续上调表达，与Wr129A2A1相比，11162-3-1T-1的RsHsfA2和RsGolS1在处理24 h后显著上调，RsHSP101、RsAPX2、RsSUS1和RsHSP25.3在处理6 h后迅速上调达到最大值，表明高温胁迫能够诱导胁迫相关基因的表达，从而提高11162-3-1T-1对高温胁迫的耐受能力。

3 讨 论

高温不仅可造成作物损伤或死亡，还会引起一系列生理及代谢物的变化。光合作用是植物对温度变化最为敏感的代谢反应，植物在高温胁迫下会减少叶绿素的合成以及叶绿体的形成[12]。研究表明，耐热型水稻可以在高温条件下通过维持较高的叶绿素含量从而提高对高温的耐受能力[13]，过表达BrHSF16的转基因拟南芥Fv/Fm显著增加，并在高温条件下表现出明显的生长优势[14]。在本研究高温胁迫条件下，耐热萝卜材料11162-3-1T-1的叶绿素含量和Fv/Fm明显高于热敏感材料Wr129A2A1，表明11162-3-1T-1可通过维持较高的叶绿素含量和Fv/Fm来调节光合作用，以此缓解高温带来的伤害。

同时，在高温胁迫下，猕猴桃、蝴蝶兰、生菜、棉花和拟南芥叶片可通过积累可溶性糖和脯氨酸来提高对高温胁迫的耐受能力[12]。在高温处理24 h后，本研究中耐热材料11162-3-1T-1叶片中可溶性糖含量是热敏感Wr129A2A1的3.18倍；虽然11162-3-1T-1叶片中脯氨酸含量随着高温处理时间的增加而增加，但与Wr129A2A1相比未见明显差异，表明11162-3-1T-1在高温胁迫下可通过提高可溶性糖含量来增强自身渗透调节能力。

另外，活性氧(ROS)水平、MDA含量、抗氧化酶活性以及抗氧化酶的转录水平常被用作细胞膜和细胞膜氧化损伤的判别指标，从而反映植物对高温胁迫的耐受能力[15]。例如，高温胁迫下耐热水稻品种NERICA-L-44和Nagina 22通过增加抗氧化酶活性，减少ROS和MDA含量来提高耐热胁迫能力[13,16]；高温胁迫不但可以提高小麦、高羊茅和番茄SOD、APX、CAT、POX和GR活性[17]，还可以通过在拟南芥和水稻胞质中大量表达抗坏血酸过氧化物酶基因APX2[18-19]，从而增强植物对H2O2等活性氧的清除能力。与热敏感材料Wr129A2A1相比，本研究中高温胁迫下耐热性萝卜材料11162-3-1T-1叶片的 MDA和H2O2含量下降，SOD和APX活性以及RsAPX2基因的表达量增加，表明高温胁迫产生的H2O2在SOD和APX协调作用下维持在较低水平, 从而减少细胞膜的损伤, 提高了11162-3-1T-1对高温胁迫的耐受能力。

此外，HSF作为热胁迫信号转导途径中的重要组成部分, 能够诱导多种热胁迫响应基因的表达，在植物应对高温胁迫、生长和发育方面发挥重要作用[20]。例如，拟南芥AtHsfA2 缺失突变体对高温、强光、缺氧和氧化胁迫敏感，而过表达AtHsfA2能提高转基因植株对高温、高盐、氧化以及渗透胁迫的耐受能力[11,21]。AtHsfA2还可通过调控HSP、APX2、SUS以及GolS1等基因的表达来提高植物的耐热性[11,22-23]。与Wr129A2A1相比，耐热材料11162-3-1T-1胁迫相关基因在高温处理过程中发生显著变化，RsHSP101、RsHSP25.3、RsAPX2和RsSUS1基因在高温处理6 h后显著上调，RsHsfA2和RsGolS1在整个处理期间上调表达，表明高温诱导多种热胁迫响应基因通过不同的表达模式来提高11162-3-1T-1对高温胁迫的耐受能力。

综上所述，耐热萝卜材料11162-3-1T-1可通过调控光合作用、提高渗透调节物质含量、增加抗氧化酶活性以及激活热激胁迫相关基因表达，从而增强幼苗对高温胁迫的耐受能力。