儿童双耳感音神经性聋临床特点及GJB2与GJB3基因突变分析

王团，蔡爱军，张运波，吴琼芳，张社江

(邯郸市眼科医院 邯郸市第三医院 耳鼻咽喉头颈外科，河北 邯郸 056001)

双耳感音神经性聋是一种听力障碍性疾病，多发生于儿童，主要发病原因是由于机体的感音和传音器官以及听觉传导通路中的听觉神经和各级中枢神经出现病变，从而导致机体出现不同程度的听力减弱[1-2]。临床往往通过耳聋基因检测对耳聋患者病变基因进行分析，即通过对人体的DNA进行检测，发现患者存在的耳聋基因突变位点，尤其对于耳聋者而言，若其为家族性先天性耳聋成员，对其进行基因的检测和分析，在很大程度上避免耳聋的再次发生具有一定的治疗和预防价值[3]。近年来，随着耳聋基因研究的逐渐增多，越来越多报道显示缝隙连接蛋白26(gap junction beta2，GJB2)基因、缝隙连接蛋白31(gap junction beta3，GJB3)基因是我国耳聋儿童中较为常见的两种致聋基因[4-5]。已有研究发现双耳感音神经性聋主要通过常染色体隐性遗传，其中由GJB2基因和GJB3基因导致的耳聋占据43%以上，而导致重度以及极重度语前聋的发生率在40%以上[6]，因此对耳聋患者的基因和基因分型进行正确的分析，可使其尽早接受临床诊断和针对性治疗，改善儿童听力的预后，因此本研究通过对双耳感音神经性聋儿童临床表现及GJB2基因和GJB3基因特点进行分析，为儿童临床诊断和治疗提供依据，现将报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究选取2020年3月—2021年3月在本院健康体检及耳鼻咽喉门诊接受治疗的150例双耳感音神经性聋患儿作为研究对象，纳入研究组，其中包括男95例，女55例；年龄在2个月至3岁，平均年龄(1.77±1.13)岁；其中包括85例先天性耳聋和65例后天性耳聋，包括46例双耳对称性耳聋和104例非对称性耳聋；汉族133例，少数民族17例。选择同期参与体检的150例听力正常的儿童作为对照组，包括男91例，女59例；年龄在7个月至3岁，平均年龄(1.76±1.35)岁；汉族129例，少数民族21例；所有正常儿童经听力检测和体格检查均正常。比较两组儿童年龄、性别等临床一般资料，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有患者均签署知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会审核批准。

纳入标准：①均确诊为双耳感音神经性聋；②耳聋儿童和健康儿童临床资料均齐全；③儿童年龄28 d至14岁；④均与儿童家属取得联系，获得家属知情同意。排除标准：①临床病历资料不完整；②年龄小于28 d或大于14岁；③患儿合并重大疾病史，如先天性心脏病等；④无中耳炎等耳部疾病；⑤严重肝肾功能不全儿童；⑥存在血液系统疾病等儿童。

1.2 研究方法

听力测试检测：①声导抗检测：临床上常用的声导抗测试主要包括3 部分：鼓室图、同对侧声镫骨肌反射(简称声反射)和咽鼓管功能测试；②耳声发射检查：若耳声发射能引出，说明外中耳健康，耳蜗功能正常，但并不能反映蜗后的情况。若耳声发射未引出，说明耳蜗可能存在病变，需要通过其他检查结果来综合判断病变位置。

采集受检者手臂外周静脉血样本，采用上海华舜生物工程有限公司生产的试剂盒提取血液白细胞基因组DNA。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增GJB2、GJB3基因编码区。扩增完成后，向50 μL的反应体系中加入100 ng基因组DNA，加入后再次添加入10倍缓冲液(含15 mmol/L MgCl2)5 μL，之后使用5 μL 10倍脱氧核苷三磷酸，取2.5 μL浓度为2 μmol/L的上下游引物，并向其中加入1 μL DNA聚合酶。PCR反应于热循环仪(美国ABI生物公司)进行。反应条件设置如下：94 ℃条件下5 min，随后再放置30 s，完成后将其置于58 ℃条件下放置30 s，最后将其置于72 ℃条件下30 s，共对其进行30次循环反应，最后将其置于72 ℃条件下，使其反应5 min。扩增产物于4 ℃下冷藏保存。取4 μL PCR产物，采用1%琼脂糖凝胶电泳法检测，得扩增片段长944 bp。GJB2、GJB3测序结果分析在DNAstar软件上完成。序列：GJB2上游引物5’-AGAGAATGGAGAGTGAGGCTACC-3’，下游引物5’-CCAGGCATGGACAGAGGGAT-3’；GJB3上游引物5’-TCGTGGGTCGTGTCTTGTGTTGC-3’，下游引物5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.3 观察指标

①观察两组儿童GJB2、GJB3基因检测结果；②观察研究组患儿耳聋程度；③观察研究组不同程度聋患儿GJB2、GJB3基因突变率检测情况及突变位点情况；④观察研究组患儿双亲GJB2、GJB3基因突变检测情况。

1.4 统计学方法

将数据进行汇总整理，建立数据库，使用SPSS 24.0软件进行统计学分析，对所得数据进行正态性和方差齐性检验，以百分比(%)表示计数资料，采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组儿童基因检测结果

研究组患儿中存在5种GJB2基因致病突变，分别为235delC、35insG、176-191del16、257C>G、95G>A，其中GJB2基因突变共50例，占33.33%(50/150)，40例与235delC突变相关，占携带GJB2基因突变患者总数的80.00%；多态性基因改变3种，共95例(79G>A、341A>G、427C>T)。GJB3基因突变共5例，占比3.33%(5/150)，包括538C→T和547G→A。对照组150例儿童发现GJB2基因突变共计3例，占2.00%(3/150)，发生致病突变有两种，分别为95G>A和235delC，均为杂合突变；发生多态性基因改变有两种，即79G>A和341A>G，未发现GJB3基因突变。研究组儿童235delC突变率显著高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 等位基因染色体突变谱 (条)

2.2 研究组儿童耳聋程度检查结果

对研究组所有患儿进行纯音测听检查和听性脑干反应检查，根据WHO听力减退分级标准划分[7]，检测结果发现轻度(26～40 dBHL)25例、中度(41～60 dBHL)36例、重度(61～90 dBHL)49例、极重度(≥90 dBHL)40例。

2.3 研究组不同程度聋患儿GJB2、GJB3基因突变率检测

研究组150例患儿中，极重度患儿GJB2、GJB3耳聋基因突变阳性检出率较高，占比分别为33.33%和7.5%，见表2。

表2 研究组不同程度聋患儿GJB2、GJB3基因突变率检测 [例(%)]

2.4 研究组不同程度聋患儿GJB2、GJB3基因突变位点情况

重度和危重度组致病突变位点例数显著高于轻中度组，多态性改变例数低于轻中度组(P均<0.05)，见表3。

表3 研究组不同程度聋患儿GJB2、GJB3基因突变位点情况 [例(%)]

2.5 研究组患儿双亲GJB2、GJB3基因突变检测

研究组150例患儿父母(共300人)中发现父亲GJB2基因突变17例，占比5.67%；母亲基因突变25例，占比8.33%。GJB3基因突变父亲3例，占比1.00%，母亲1例，占比0.33%，且对应患儿均检出GJB2基因突变阳性，但父母亲均未发现纯合突变和复合杂交突变及GJB3突变，与常染色体隐性遗传相符，见表4。

表4 研究组双亲GJB2、GJB3基因突变检测 (例)

3 讨论

双耳感音神经性聋一方面是机体耳蜗的螺旋器发生病变，正常耳蜗螺旋器可以将接受的声波转变成神经兴奋，而发生病变的耳蜗螺旋器则失去该项功能；另一方面是由于机体的神经或中枢神经出现障碍，无法将接收的外界神经兴奋正常传入[8-9]。有研究指出，当患者的大脑皮质中枢发生病变后，无法将语言进行分别，而经初步的听力检查也无法将感音性聋、神经性聋、中枢性聋进行详细的区分，因此患者均属于双耳感音神经性聋[10]。对耳聋患儿而言，其生长和发育受到严重影响，甚至会导致儿童出现终生残疾，所以临床中合理有效的早期诊断和治疗对儿童的预后具有重要意义[11]。

GJB2基因突变是隐性遗传耳聋的首要危险因子，该突变的临床分型包括错义突变、移码突变、无义突变等[12]。由GJB2基因突变而导致的双耳感音神经性聋患者，大多为双侧对称性耳聋，对于机体听力的损伤较为严重，大多患者临床表现为重度或极重度耳聋[13]。相较于其他基因，GJB2基因突变具有较为丰富的多态性表达，因此，明确GJB2基因突变的类型，分析其属于致病突变还是多态性表达对临床诊治具有很高的价值，本次研究中通过对150例双耳感音神经性聋儿童父母进行分析，发现父母亲均未发现纯合突变和复合杂交突变，因GJB2基因发生突变的主要原因是由于机体多数常染色体发生异常，其表现为隐性遗传性耳聋，所以本研究结果符合常染色体隐性遗传[14]。刘闽等[15]研究报道指出GJB2基因的突变在我国不同地区的双耳感音神经性聋检测中占4%～35%，主要突变为235delC。与本研究结果一致，在本次研究中，GJB2基因突变共50例，其中42例与235delC突变相关，占携带GJB2基因突变患者总数的84.00%，多态性基因改变3种(79G>A、341A>G、427C>T)。本次研究中还对GJB3基因进行分析，发现GJB3基因突变共6例，包括538C→T和547G→A，占4.00%，显著低于GJB2基因突变，此外，本研究发现150例双耳感音神经性聋儿童父母中父亲GJB2基因突变17例(5.67%)，母亲基因突变25例(8.33%)；GJB3基因突变父亲3例(1.00%)，母亲1例(0.33%)，分析其原因主要是由于遗传基因多态性会伴有一定遗传性状，对于个体而言，其体内的DNA分子结构均不同，但这对于机体的基因功能和表达性状不会产生影响[16]。虽然本研究发现多种多态性基因，但在基因序列中一些区域的突变仅会导致基因出现多态性，仅产生独立作用，不会引起机体异常，如不参与蛋白质合成的片段或对机体的调节无显著作用的片段等[17]。

GJB3基因的突变在一定程度上可能会引起机体常染色体显性或隐性遗传性神经性耳聋，该基因的突变将会改变GJB3中的第二细胞区出现改变，主要表现为语后听力感音神经性耳聋[18]。本研究通过对不同程度耳聋的儿童进行基因检测，发现GJB2、GJB3基因突变极重度阳性检出率较高，占比分别为22.50%和7.5%，且重度和危重度组致病突变位点例数显著高于轻中度组，多态性改变例数低于轻中度组(P均<0.05)，提示临床医生不应忽视轻度和中度感音神经性聋儿童遗传学基因的检测。还有研究指出，GJB2基因突变对不同种族的人群具有差异性，即不同人群GJB2基因各种类别突变发生频率具有较大差异[19-20]，但本次研究由于地域和时间等限制，未对不同种族人群进行GJB2基因突变的分析，今后研究中可以将患者的选取范围进一步扩大，对不同种族人群的GJB2、GJB3基因进行分析，探究不同种族儿童双耳感音神经性聋GJB2、GJB3基因突变情况，为患儿的治疗和诊断提供依据。

GJB2、GJB3基因突变检测可以作为产前诊断的一种方法，利于有效诊断耳聋的发生率，从而做到尽早干预，值得在临床推广应用。