基于半花菁素近红外荧光探针的研究进展

尹正思，张富凯，张腾博,刘文豪，程鹏飞,徐括喜

(河南大学 化学化工学院, 河南省工业冷却水循环利用工程技术研究中心, 河南 开封475004)

荧光探针因具有灵敏、高效、原位无创检测等优点正在逐步应用于各种分析物的检测[1-2]。半花菁染料具有较好的生物相溶性和水溶性、相对较长的吸收和发射波长、大的斯托克斯位移、较高的量子产率、较大的摩尔消光系数等优点，尤其是半花菁染料具有的近红外(NIR)荧光发射特性，可以克服细胞内生色团的自发荧光及在生物组织渗透方面的干扰最小，同时近红外荧光探针在对分析物检测时多伴随有颜色变化的优点，无需仪器即可通过肉眼识别。因此这类探针正日益引起广大科研工作者的广泛关注[3-4]。对半花菁染料进行结构修饰得到的衍生物能够高选择性的识别金属阳离子、阴离子、小分子等多种分析物而被应用于环境、食品、医药和生物诊断等领域。本文将近几年来以半花菁为荧光团的小分子荧光探针的研究进展进行了综述。

1 金属阳离子荧光探针

金属广泛存在于自然界的各个角落，与我们的健康密不可分。1973年，世界卫生组织(WHO)公布了14种人体必需微量元素，其中有十种是金属元素，它们都具有强大的生物学作用，与生物体的生理健康息息相关。但是，过量金属离子和其他不必要的金属离子，会导致严重的环境问题并对人体健康有害。因此检测金属阳离子的荧光探针受到了广泛关注[5-6]。

铁是人体中较丰富的微量元素，是血液中运输氧气、合成酶、DNA和RNA并调节细胞渗透压的重要元素[7]。由于铁离子的顺磁特性不利于体内荧光成像，因此大多数报道的铁离子荧光探针均为荧光猝灭型[8]，而增强型荧光探针可以克服因细胞自吸收带来的困扰，因此开发Fe3+离子的“开启”型荧光探针就显得尤为重要。同时，铝作为一种生命系统不必要且有毒的金属，是分布在环境中的最丰富的金属之一[9]。高浓度的Al3+对人体健康有害，导致多种疾病，例如老年痴呆症、骨质疏松症等[10]。因此，WHO提出人类每日平均摄入铝的量应少于3～10 mg[11]。因此，开发选择Al3+离子的探针对于环境保护和人体健康具有重要意义[12]。与一种探针只检测一种分析物相比，用一种探针检测多种分析物更适合实际应用。用单一探针检测多种分析物的研究正日益引起更多科研工作者的兴趣[13-14]。我们课题组[15]开发的一种通过半菁醛与2-氨基苄醇的缩合一步合成的席夫碱荧光探针1(见图1)。探针1在DMF-HEPES(体积比为1∶5)缓冲溶液中通过从黄色到红色或粉红色的明显颜色变化，显示出对各种金属离子中的Fe3+和Al3+的高度选择性。探针在Fe3+或Al3+存在下表现出明显的荧光开启响应，在580 nm处发出强发射峰，应归因于光致电子转移(PET)的抑制现象和螯合增强荧光(CHEF)的表达。探针1的检出限(LOD)表明对Fe3+(2.21×10-8mol·L-1)和Al3+(2.46×10-8mol·L-1)具有较高的灵敏度，对Al3+的缔合常数(3.49×106L·mol-1)高于对Fe3+的缔合常数(4.54×104L·mol-1)，这可能是因为探针1形成的空腔大小更适合与Al3+相互作用。因此当先将Fe3+添加到配体溶液中，再将Al3+添加到配体溶液中时，可以同时检测到这两种金属离子的荧光，反之则不然。探针1不仅能在水介质中可通过“turn on”型荧光响应高选择性检测Fe3+和Al3+，还实现了对活细胞中Fe3+和Al3+检测的实际应用。

图1 探针1与Fe3+和Al3+的识别模式图

铜作为人体中第三种最丰富的微量元素，它在许多基本的生理过程，如造血、各种酶催化和氧化还原反应中起着至关重要的作用[16-17]。但是，过量的铜是有剧毒的，会引起氧化应激和各种神经退行性疾病[5,18]。因此，开发检测Cu2+的选择性探针非常重要。尽管目前已经报道了许多Cu2+探针，但是由于Cu2+的顺磁特性，只有很少的“开启”型荧光探针[19-20]。我们以半菁醛和邻氨基苯酚为原料制备的席夫碱探针2[21]，探针2在半花菁环和邻氨基苯酚环的扭转后恰好提供一个具有两个氧原子和一个氮原子的空腔结构，这个空腔的大小和空间构型非常有利于和Cu2+形成稳定的配合物(图2)。在探针2的MeCN/HEPES(4∶1，pH = 7.3)溶液中加入Cu2+, 探针2通过-C=N-基团上的N原子、花菁环上的醚氧以及酚芳基单元的-OH中的O原子与Cu2+形成1∶1 络合物。探针2还成功地应用于HepG2细胞中Cu2+荧光镜像实验。

图2 探针2与Cu2+的识别模式图

钯是一种重要的过渡金属，在汽车、电子、珠宝和化学工业等方面应用广泛，残留的钯会抑制酶的生成并对细胞DNA、蛋白质和氨基酸造成严重损伤[22]。Chen等[23]基于近红外荧光团和对芳基炔丙基醚的脱保护作用，设计并合成了一种用于检测Pd2+的新型近红外荧光探针3(图3)。在645 nm激发下，游离探针仅表现出很弱的荧光强度，而在探针3的溶液中逐渐添加Pd2+后会引起较大的荧光增强，当Pd2+的浓度达到1.0当量时，在716 nm处最大荧光增强(增强到43倍)。与已知的荧光钯探针相比，这种荧光增强效果是非常优越的，并且发光区域是近红外光区而非可见光区。在选择性测试中，探针仅对Pd2+做出响应而对其他金属离子不产生反应。因此探针3可以高灵敏度和选择性地对Pd2+做出荧光“开启”的比率型响应。探针还可以通过荧光成像监测活Hala细胞中的Pd2+。

图3 探针3与Pd2+的识别模式图

汞作为致命有毒元素, 主要来源于黄金生产、燃煤电厂、温度计、气压计和汞灯[24]。因此开发检测Hg2+荧光探针就显得日益迫切。Wei等[25]报告了一组新型的近红外混合荧光团，即杂色铬腈-花青荧光团(CC-Fluor)，其中荧光强度和发射波长都可以通过构象变化和取代基进行调节。与已知的NIR荧光团相比，新型CC-Fluor在NIR探针开发方面具有显着优势：1)CC-Fluor具有可调的和适中的斯托克斯位移以及量子产率；2)具有很好的生物相容性，在细胞中长期孵育后，荧光团在生理条件下是稳定的；3)CC-Fluor的最大吸收与主流体内成像系统中常见的激光光谱波长一致；4)最重要的是，CC-Fluor可以轻松修改以制备针对各种生物物种的NIR探针。CC-Fluor的实用性实验表明新的NIR探针4具体两种功效，一是比例式pH，另一个是“开启”型的Hg2+探针(图4)，成功应用于活体动物成像中。在对汞离子的识别中，探针对Hg2+表现出了出色的选择性和灵敏性，并具有良好的光谱稳定性。因此，该研究确认了CC-Fluor可以作为开发用于检测生物系统中物种的NIR探针的出色荧光团。

图4 探针4与Hg2+的识别模式图

2 阴离子荧光探针

阴离子在生物系统中无处不在，起着不可替代的作用。它们与人们的日常生活息息相关，并对人体健康和环境起着十分重要的影响[26]。如氟离子是人体必需的微量元素之一，适量的氟离子可促进发育、预防龋齿和稳健骨骼，然而过量的氟离子会引起氟斑牙以及骨骼变化，最终导致四肢畸形和瘫痪[27]。

Tisan等[31]报道了一种荧光发射约为780 nm的比率型近红外荧光探针5，并将其应用于饮用水和白面粉中的氟离子检测以及活细胞和小鼠的荧光成像中(图5)。所提出的探针不仅显示出线性比例(F 740/F 690 nm)荧光响应，而且具有近红外波长，检测极限为0.2 μmol·L-1。而且，所设计的探针5对F-具有很高的选择性，这使得在饮用水和白面粉中检测F-成为可能。更重要的是，其具有良好的生物相容性和低细胞毒性，被用于监测活HepG2细胞和雄性BALB/c小鼠体内的F-。该探针有望在生物系统和体内研究中的检测中发挥其巨大的潜力。

图5 探针5与F-的识别模式图

彭梦姣课题组[32]以香豆素-半花菁共轭物为荧光团，利用氰根离子对极化的-C=N-双键具有强亲核性的特点，合成了一种新型荧光探针6(图6)。该探针通过将苯并咪唑引入香豆素母环，改善了香豆素荧光团的荧光性质，使香豆素的最大发射波长红移了30 nm，荧光量子产率明显提高。还研究了探针6用于检测氰根离子的方法学、动力学等问题，实验结果证明，探针可以在短时间内对氰根离子表现出明显的颜色变化和光谱变化，可以实时、便捷地用肉眼检测氰根离子。通过引入磺酸基修饰，可以达到在纯水溶液中检测氰根离子的目的，检测过程不需要借助任何助溶剂，更有利于在实际样品(各种自然水系、工业废水等)中检测氰根离子。因此作者提供了一种水溶液中快速、便捷、高选择性的氰根离子检测体系，可不借助任何助溶剂及仪器直接检测样品中的氰根离子，这种可以便捷使用的性质为探针的市场化提供了很大的潜力。

图6 探针6与CN-的识别模式图

崔海军课题组[33]设计合成了一种用于检测亚硫酸氢根的新型比率型荧光探针7。该探针以两个半花菁结构为基础荧光团，利用亚硫酸根的还原性实现对探针的响应(图7)。在荧光光谱研究中，加入亚硫酸钠后，750 nm处的荧光强度明显下降，530 nm处的荧光明显增强，而对于其他金属阳离子或阴离子的响应则是不明显。在探针与亚硫酸钠的光谱滴定实验中，随着加入的亚硫酸钠浓度不断增加，530 nm处的峰不断升高，750 nm处的峰不断降低，达到饱和时，荧光强度增加了70倍左右。为揭示探针对亚硫酸氢根的识别机理，作者还利用质谱对识别过程进行了表征，并发现了识别后的产物质子峰。另外，作者还利用探针在Hala内对亚硫酸氢根进行了荧光成像实验，并取得了良好的效果。

图7 探针7与的识别模式图

2020年，吕荫妮课题组[34]设计合成了基于双8-羟基喹啉半花菁染料铜离子复合物识别硫离子的荧光探针8，利用置换的方式可以可视化识别环境样品中的硫离子(图8)。通过紫外-可见光谱和荧光光谱研究了探针对硫化物的传感性能，结果表明，荧光探针对硫离子具有非常高的选择性和抗干扰能力，不受其他分析物的干扰，荧光滴定光谱中随着不同浓度硫离子的加入，谱图呈现均匀的变化，探针溶液的荧光强度变化与S2-(0～5 μmol·L-1)的浓度呈现良好的线性关系(R2= 0.998 4)，其检测限低至0.12 μmol·L-1，反应动力学显示探针识别硫离子仅需要30 s，其准一级动力学常数k为(1.13 ± 0.12)s-1，可以实现快速检测的目的，比色图像也呈现明显的颜色变化，可以实现可视化半定量分析环境样品中硫离子的含量。

图8 探针8与Cu2+和S2-的识别模式图

我们课题组[35]开发了新型近红外荧光探针9用于检测SHSY5Y细胞和小鼠中HS-的存在。探针9具有显着的颜色变化(从紫色变为灰蓝色)、快速响应(在0.5 min内)、显着的NIR发射(760 nm)和高选择性(相对于其他分析物)和灵敏性(极限为H2S的检测是10 nmol·L-1)。通过1H NMR和质谱分析证实了探针对H2S的传感机制。此外，探针9可用于检测活的SHSY5Y细胞和生物体中的外源性和内源性H2S。该探针将有希望揭露H2S在生理和病理过程中所起到的决定性作用。

图9 探针9与HS-的识别模式图

3 小分子荧光探针

在生物系统中扮演着重要角色的小分子更是备受医学及分析领域的关注。一些生物体内重要的氨基和功能性生物小分子的检测也意义非凡[36]。酶在生物体内对生理过程起着至关重要的作用，也是生命体内存在的最为复杂的反应过程之一。异常的酶活性与癌症的发展直接相关。鉴定这些酶在活癌细胞中的位置和表达水平在早期癌症诊断和监测治疗效果中具有重要意义[37]。对酶催化过程产生物质的检测如生物小分子化合物，也能够在一定程度上说明其催化酶的含量，因此对生物小分子的检测及与之相关的酶催化生理病理过程的探索具有十分重要的意义[38]。小分子荧光探针具有较高的灵敏度，无损快速分析和实时检测功能，已成为检测和成像生物系统中酶活性的强大工具，因此对生物小分子的检测也是需要分析和医学领域竭力探索的一大科研问题[39]。

Qi等[40]报告了一种高选择性和灵敏性的具有大斯托克斯位移的NIR开启荧光探针10，用于在体内检测半胱氨酸(Cys)。Cys作为重要的生物硫醇，在许多生理过程(例如蛋白质合成，排毒和代谢)中起着重要作用，并且还与多种疾病密切相关；因此，对用于体内Cys检测的新型高选择性，灵敏的NIR荧光探针的设计具有重要意义。将半胱氨酸添加到探针溶液中后，吸收波长从550 nm移至600 nm，同时伴随着以760 nm为中心的NIR荧光发射明显增强(图10)。这种基于迈克尔加成反应的探针显示出较大的斯托克斯位移(160 nm)、低检测限(48 nmol·L-1)、响应时间快和低毒性。此外，这种具有良好细胞渗透性的新型NIR探针已成功应用于监测活细胞和小鼠模型中的内源性半胱氨酸。

图10 探针10与半胱氨酸的识别模式图

Zhang等[41]成功构建一种新型的可特异性识别酪氨酸酶的水溶性NIR荧光探针11，并用于活细胞和斑马鱼中酪氨酸酶的成像(图11)。黑色素瘤是一种侵袭性皮肤恶性肿瘤，是最致命的皮肤癌。在过去的几十年中，其发病率迅速增加。酪氨酸酶(TYR，EC 1.14.18.1)是一种含铜的单加氧酶，可以催化酪胺或酪氨酸氧化为醌，从而触发黑色素的形成。黑色素在黑色素瘤的发展中起关键作用。TYR在黑色素瘤癌细胞中的过量表达被用作诊断和预后黑色素瘤的独立生物标志物。因此，简单、准确地检测TYR对于生物学系统的基础研究和黑色素瘤的临床诊断具有实际意义。探针11可特异性地对TYR做出响应，并且该探针已成功应用于异种小鼠模型中的黑色素瘤的诊断。

图11 探针11与酪氨酸酶的识别模式图

Xu等[42]开发出了具有高灵敏度、良好的特异性和良好的光稳定性的近红外探针12，用于监测活细胞中的外源和内源H2O2(图12)，并首次成功地用于监测雷帕霉素诱导的线粒体自噬过程中产生的过氧化氢。过氧化氢是活性氧(ROS)的重要组成部分，由线粒体呼吸作用通过某些氧化还原酶氧化而产生。在所有ROS中，过氧化氢具有最低的反应活性和相对较长的半衰期，这使其可以跨膜扩散并在多个细胞室内传递信号。作为第二信使，过氧化氢与各种细胞过程紧密相连，例如生长、增殖、分化和迁移。因此，过氧化氢的浓度被精确地调节，并且过氧化氢的调节失调可能是有害的，并且涉及许多疾病，例如神经变性、心血管疾病、糖尿病和癌症。除了在细胞中的成像外，小鼠成像实验也表明该探针具有良好的潜力，可用于活体生物系统成像。因此，该探针可用于监测活细胞中过氧化氢，尤其是线粒体等特定区域的过氧化氢，以进行生物学研究和早期疾病诊断。

图12 探针11与H2O2的识别模式图

He等[43]通过将半花菁和丙氨酰基结合，首次开发了用于氨基肽酶N的近红外荧光探针13(图13)。该探针具有很高的选择性和灵敏度，检出限为0.8 μg·L-1。氨肽酶N(APN，也称为分化抗原或CD13的第十三簇)是一种165 kDa的967个氨基酸的完整膜蛋白，包含9个氨基酸的短胞质N末端区段和较大的细胞外COOH-终端域。该胞外域包括特征性的M1锌结合金属蛋白酶活性位点，该活性位点可以切割短肽N端的中性氨基酸残基。最初，APN通过其抗原性被鉴定为CD13，该抗原性用于促进人类白血病细胞的分类。然而，近几年对APN更多的关注是其在实体瘤中的蛋白水解活性的作用，其中就有其调节肿瘤转移并因此成为癌症标志物。一些研究人员推测，在迁移过程中，恶性细胞表面的APN通过其蛋白水解活性进入细胞外循环，参与细胞外基质的降解，而另一些研究人员则将APN视为通过配体缔合传导与迁移相关的信号的膜受体，与蛋白水解活性无关。另外，据报道APN在许多恶性肿瘤中过表达，这使得APN成为癌症诊断和预后有希望的标志。作者使用该探针对活细胞和小鼠体内氨基肽酶N进行了成像，这表明该探针可用于研究该酶的功能。

图13 探针13与氨肽酶N的识别模式图

Cai等[44]成功开发出了一种高度选择性和灵敏性的“开启”型NIR荧光探针14，用于溶酶体中ACP的检测和成像(图14)。该探针由一种新型的发射近红外光(λem= 765 nm)的硫氧杂蒽-吲哚染料SHCy作为基础荧光团，通过羟基的磷酸化成功获得探针14。该探针具有一些独特的特性，例如在近红外区域具有显着的光谱信号和细胞通透性。根据ACP催化的探针14中磷酸基团的裂解，该探针对ACP的“开启”荧光检测具有很高的选择性和灵敏度。该探针靶向溶酶体，并已成功用于溶酶体中ACP的荧光成像。同时，该探针还可用于筛选潜在的ACP抑制剂。因此，该探针对于从事溶酶体ACP对生物系统影响研究的研究人员将大有裨益。

图14 探针14与ACP的识别模式图

Zhang等[45]设计合成了一种优异水溶性、高选择性和高灵敏度的NIR荧光探针15，该探针将一个新的水溶性荧光团与一个识别基团相连，该基团可以避免ROS干扰并特异性识别TYR，因此该探针对TYR的识别可不受生物体内复杂环境的影响。在紫外可见吸收和荧光光谱研究中，探针在600 nm处具有最大吸收，与TYR反应后，最大吸收峰在670 nm附近。荧光光谱中，随着TYR添加量的增加，探针在708 nm处显示出逐渐增强的荧光信号。值得注意的是，反应体系的吸收光谱和荧光光谱与探针前一步的羟基结构相似，量子产率为0.18，表明游离荧光团是由TYR引发的裂解反应引起的。探针在生理温度和pH范围内高度稳定，能够在生物系统中准确检测TYR，且不受普遍存在的实体的干扰。该探针已成功应用于异种小鼠模型中的黑色素瘤的诊断，并显示出低毒性、高特异性、高灵敏度和良好的光稳定性方面的有利特性。探针的优越性能使其在其他生物系统和体内成像研究中具有巨大的潜力。

图15 探针15与TYR的识别模式图

4 结语与展望

综上所述, 由于半花菁类荧光染料具有较高的荧光量子产率、良好的水溶性和生物相容性等特点，近年来获得较快的发展。虽然基于半花菁类荧光探针在检测各种阳离子、阴离子和中性小分子等方面显示出良好的前景，但仍需要对半花菁类荧光探针进行结构改造以满足亚癌细胞结构成像和体内成像需要，同时探针的选择性和灵敏度仍有待提高。随着超高分辨率荧光显微镜等成像设备的开发，具有靶向性和生物相容性好的近红外荧光探针在成像领域正成为研究重点之一。尤其是随着逐步深入的理论研究和成像设备技术的发展，在细胞、活体内的具有广泛应用前景的近红外荧光探针会得到广大科研工作者的关注。因此，开发基于半花菁类的近红外荧光探针在今后的研究中具有较好的前景。