不同环境下厌氧氨氧化菌对盐度的响应及生物量作用

苏 杨，杨 宏

（北京工业大学城市建设学部，北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京 100124）

厌氧氨氧化（ANAMMOX）是一种新型的微生物氮转化途径。厌氧氨氧化菌能够氧化氨氮并生成N2，无需有机碳源和O2，减少药剂投加费用和曝气能耗〔1−2〕。尽管厌氧氨氧化较常规污水脱氮工艺具有明显优势，但厌氧氨氧化菌对环境参数如温度和盐度非常敏感，阻碍了其进一步应用〔3〕。随着工业活动与海水利用程度的增加，需要处理的含盐含氮废水增多〔4−5〕。厌氧氨氧化系统中微生物的菌群结构可能影响厌氧氨氧化性能及在不利环境下的抵抗能力。因此，考察盐浓度对厌氧氨氧化菌的影响具有重要意义。

厌氧氨氧化相关工艺的最佳温度范围在30~37 ℃，多应用于温度较高的场景（如污泥消化液）〔3〕。厌氧氨氧化菌在15 ℃下的活性仅为35 ℃的1/10〔6〕。即使具有较高的活性，10 ℃的低温条件下仍需700 d 的培养才能获得适应低温的厌氧氨氧化菌〔7〕。这对厌氧氨氧化菌在低温条件下的脱氮效能提出挑战。

低盐度对于实验室中温运行的厌氧氨氧化反应器具有正向刺激作用〔8〕，低温环境下低盐度对厌氧氨氧化菌降解能力的影响尚不清楚。此外，高盐度会降低细胞活性。盐度条件下对厌氧氨氧化菌的增殖不利，导致厌氧氨氧化技术处理含盐废水非常困难。研究表明，当反应体系中的污泥生物量>10 g/L，厌氧氨氧化菌对盐度（30 g/L）的适应时间缩短〔9−10〕。生物量在厌氧氨氧化菌适应盐度中发挥的作用也有待进一步研究。笔者选用一系列SBR反应器，探究盐度促进或抑制厌氧氨氧化菌的浓度阈值及菌群变化，比较中、低温条件下低盐度对厌氧氨氧化菌脱氮效能的影响，评估高盐度冲击下厌氧氨氧化菌对生物量的响应规律，以期为厌氧氨氧化工艺处理含盐废水的优化控制提供一定理论参考。

1 实验部分

1.1 实验材料

接种污泥为实验室储备的厌氧氨氧化颗粒污泥。实验用水为人工配水，NH4+−N、NO2−−N 分别由（NH4）2SO4和NaNO2提供，以静置24 h 后的自来水稀释至目标浓度。

无机培养液包括1.25 g/L NaHCO3、0.15 g/L CaCl2·2H2O、0.3 g/L MgSO4·7H2O、0.05 g/L KH2PO4、0.025 g/L FeSO4·7H2O，以及1 mL/L 的微量元素Ⅰ和Ⅱ。微量元素组成〔11〕见表1。基质pH 由体积分数为1%的H2SO4溶液控制在7.7~8.0。

UV752N 紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司），便携式溶解氧仪（美国HACH 公司），pHS-3C 型便携式pH 计（上海仪电仪器有限公司），ZHWY-2102C 恒温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.2 实验方法

（1）无添加/添加盐度对厌氧氨氧化菌的促进及抑制实验。在2 L SBR 反应器中培养厌氧氨氧化污泥12 d，然后等分为2 部分，即对照组A0 和含盐组A1，在有效体积为1 L 的SBR 反应器中于35 °C 下恒温运行。SBR 循环周期为24 h（注入5 min，反应23.5 h，沉降20 min，出料5 min），换水比例为80%。初 始进水中氮质量浓度为225 mg/L〔m（NO2−−N）∶m（NH4+−N）=1.2∶1〕，A1 中的盐逐渐增至14 g/L，每2 d 盐度提升1.0 g/L。

（2）典型中、低温条件下低盐度对厌氧氨氧化颗粒污泥的短期影响实验。设置4 个有效体积为0.5 L 的SBR 反应器，用蒸馏水调节相同的最终污泥质量浓度（以VSS 计，约8 g/L）。在恒温振荡培养箱中设置不同的盐度及温度（B1：0、35 ℃；B2：5 g/L、35 ℃；B3：0、15 ℃；B4：5 g/L、15 ℃）。初始进水中氮质 量 浓 度 为225 mg/L〔m（NO2−−N）∶m（NH4+−N）=1.2∶1〕，SBR 循 环 周 期 为24 h（注 入5 min，反 应23.5 h，沉降20 min，出料5 min），换水比例为80%，共运行35 d。

（3）不同生物量下盐度对厌氧氨氧化颗粒的短期抑制实验。设置4 个有效体积为0.5 L 的SBR 反应器（C1、C2、C3、C4），用蒸馏水调节最终污泥质量浓度分别约4、6、8、10 g/L（以VSS 计）。初始进水中氮质量浓度为225 mg/L〔m（NO2−−N）∶m（NH4+−N）=1.25∶1〕，SBR 循 环周期为24 h（注 入5 min，反 应23.5 h，沉降20 min，出料5 min），换水比例为80%，共运行35 d。此外，盐度以5.0 g/L 为梯度，由0 g/L提升至20 g/L。

通过测定NH4+−N、NO2−−N 和NO3−−N，考察 盐度、温度及生物量对厌氧氨氧化颗粒污泥的影响。

1.3 比厌氧氨氧化活性

实验运行期间，通过批次测试测定不同盐度梯度的比厌氧氨氧化活性。

从反应器中收集厌氧氨氧化污泥样品，用磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol/L，对应pH 为7.4）洗涤3 次以去除残留底物。将1.0 g/L 的污泥加入工作体积为100 mL 的血清瓶中。初始NH4+−N 和NO2−−N 质量浓度均为150 mg/L，在培养基中加入与SBR 反应器相同的盐度（即0、5、9、14 g/L 的NaCl），用体积分数为1%的H2SO4控制培养基pH 在7.8 左右。血清瓶通入N（299.99%）10 min 以除去氧气，立即用丁基橡胶密封并放入恒温振荡器中，温度为（32±1）℃，转速为180 r/min。每小时用注射器抽取5 mL 液体，测定NH4+−N 和NO2−−N。SAA 按1.5 方 法 测 定。每 项参数重复测定取平均值。

1.4 分析方法

参照文献〔12〕对水质进行分析。NH4+−N 采 用纳氏试剂分光光度法测定，NO2－−N 采用N−（1−萘基）−乙二胺光度法测定，NO3－−N 采用紫外分光光度法测定，DO 采用便携式溶解氧仪测定，pH 采用便携式pH 计测定。

为研究厌氧氨氧化系统的菌群结构对盐度的响应，分别以接种污泥、未添加盐的对照组A0 及添加9 g/L 盐度的污泥样本进行高通量测定分析。针对V3~V4 区的16S rRNA 采用带特异性引物341F（CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTA CGGGNGGCWGCAG）/805RGACTGGAGTTCCTTGGC ACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）〔13〕进行扩增，随后在Illumina HiSeq 2500 PE250 平台上机测序。选取OTU 代表序列与数据库Silva 最新序列比对物种信息，将OTU 代表序列（97%相似水平）在门、属水平上分析样品的群落组成与丰度关系。

1.5 参数计算方法

1.5.1 比厌氧氨氧化活性

比厌氧氨氧化活性（SAA）按式（1）计算。

1.5.2 化学计量比

化学计量比按式（2）、式（3）计算。

式中：SAA——比厌氧氨氧化活性，kg（/kg·d）；

Rs——亚硝氮相对氨氮的消耗比例；

Rp——硝态氮相对氨氮的生成比例；

HRT——水力停留时间，h；

VSS——污泥质量浓度，g/L。

2 结果与讨论

2.1 盐度对厌氧氨氧化颗粒污泥的双向影响

考察了盐度对厌氧氨氧化颗粒污泥的影响，结果见图1。

如图1 所示，实验分为2 个阶段，第Ⅰ阶段（第0 天~第18 天）比较厌氧氨氧化菌在未添加（A0）/添加盐度（A1）环境下的脱氮性能。第Ⅱ阶段（第19天~第34天）继续考察A1提高盐度后的抑制浓度。从第13天开始，A1 以2 d 为单位、1 g/L 为梯度逐渐提升盐度。由于环境改变，A1 的出水基质浓度在第0 天~第5 天升高，随后逐渐降低。A0 和A1 的化学计量比Rs 在第3 天分别为1.15、1.24，与理论值1.15 相近〔14〕。

由图1（a）、（b）还可知，添加盐度在5 g/L 以下时，A1 出水始终低于A0。虽然该盐度下A1 的氮容积去除负荷（NRR）增幅略微变缓，但至第Ⅰ阶段结束时其仍高于A0，上述数据表明低盐度有助于厌氧氨氧化系统的效率提升及稳定。NRR 的增长速率可能与不同厌氧氨氧化菌属对盐度的适应性有关。盐度增至9 g/L 时A0 出水才首次低于A1，A1 在10 g/L 时出现 亚 硝 氮 积 累，NH4+−N 保 持 在20.18 mg/L，NO2−−N升 至36.12 mg/L，导 致A1 的NRR 低 于A0，约 为0.57 kg（/m3·d）。有研究表明，脱氮性能不会因低盐度（如8.7 g/L）而被抑制，但盐度超过10 g/L 后脱氮性能会逐渐变差〔13−14〕。本研究中，经过4 d 的适应期A1 出水NO2−−N 降至17.41 mg/L，表明只要保证适当的驯化梯度，厌氧氨氧化颗粒污泥能够适应该含盐量 的 废 水。但 当 盐 度 升 至14 g/L 时，NH4+−N 和NO2−−N 都 不 再降低。至 第Ⅱ阶 段结束，A1 出 水 的NH4+−N、NO2−−N 分别升至20.04、30.04 mg/L。

图1 无/有盐度对厌氧氨氧化颗粒污泥的影响的进出水浓度Fig.1 Concentration of inlet and outlet water in the non-salinity/salinity environment

进一步考察了A1 的污泥活性随盐度的变化趋势，如表2 所示。

表2 盐度对SAA 的影响Table 2 Specific anammox activity after salinity addition

由表2 可见，不同盐度条件下SAA 经历了先增长后降低的过程，盐度为5 g/L时SAA约为0.11 kg/（kg·d），高于初始状态〔0.09 kg/（kg·d）〕，表明低盐度对提高厌氧氨氧化菌的脱氮性能产生正向刺激作用。盐度为9、14 g/L 时，SAA 下降且降幅较大。整个实验过程中SAA对盐度的敏感度较高，进一步明确了盐度对厌氧氨氧化菌双向影响的浓度阈值。实验中盐度的正向刺激质量浓度为5 g/L，不宜超过14 g/L。

2.2 低盐度对中、低温下厌氧氨氧化颗粒污泥的短期影响

由2.1 可知，添加低盐度有助于厌氧氨氧化系统的稳定运行。通过4 组批次实验，考察典型低温（15 ℃）和中温（35 ℃）条件下低盐度（5 g/L）对厌氧氨氧化颗粒污泥底物的降解能力是否有促进作用，结果见图2。

由图2 可见，经过35 d 的运行，启动初期温度对厌氧氨氧化菌的影响明显。无论是否添加盐度，B1和B2 的脱氮性能均好于B3、B4（低温条件）。其中，B1、B2 的氨氮虽然在0~3 d 由12.62、16.31 mg/L 短暂上升至30.25、36.38 mg/L，但在第4 天迅速下降，比B3、B4 提前约5 d。

图2 低温低盐度对厌氧氨氧化颗粒污泥的脱氮性能Fig.2 Low temperature and salinity on the nitrogen removal performance of Anammox granular sludge

对于NO2−−N，虽然B1~B4 均呈下降趋势，但添加盐度之初B4 的出水基质显然高于其他3 组。添加盐度的B2、B4 的NO2−−N 浓度均高于同样温度的对照组B1、B3 的NO2−−N，10 d 后才实现对盐度的适应。第10 天 为B1 和B2（温 度 均 为35 ℃）出 水NO2−−N 的 转 折 点，此 后B2 出 水NO2−−N 始 终 低 于B1。而 低 温 下 的B4 出 水NO2−−N 用 时18 d 才 低 于B3，表明低温使厌氧氨氧化菌的性能下降〔15〕。至实验结 束 时，B1~B4 的NO2−−N 质 量 浓 度 分 别为7.95、0.9、20.34、16.93 mg/L。李祥等〔16〕的研究指出温度<15 ℃时，氮去除速率不足37 ℃时的1/3。而本研究中，B4 出 水NH4+−N 和NO2−−N 低 于 同 温 度 的B3 出水，略高于35 ℃的B1 出水，显示低盐度在低温系统中能够提升脱氮效能。此外，添加盐度的B4、B2 出水NH4+−N 和NO2−−N 浓度均分别低于同组的B3、B1出水，但35 ℃时的提升幅度仍高于15 ℃。

本研究和其他研究中，低于5 g/L 的盐度可以正向刺激厌氧氨氧化菌〔17〕，但在低温条件下厌氧氨氧化菌对盐度更加敏感。在同系列温度条件下，低浓度的盐主要通过增强亚硝氮的降解能力，避免低温下亚硝氮积累而引发的基质抑制。出水残留硝态氮也存在不同变化。B2 出水硝态氮先高于B1 出水，随后逐渐降至与B1 出水相似；而处于低温条件下的B4 出 水NO3−−N 始 终 高 于B3 出 水，约 为B3 的2~3倍。图2（d）显示，与B1（未加盐度）相比，加入低盐度的B2 在初始阶段更接近理论化学计量比；15 ℃时，添加盐度的B4 在初始状态不稳定的条件下，恢复效果显著。2 组同温度系列试验结束时更接近理论值。因此认为低温条件下，低浓度盐同样可以促进厌氧氨氧化工艺的启动及提高稳定性。

2.3 高盐度冲击对不同生物量厌氧氨氧化颗粒污泥的短期抑制

不同于低温低盐度条件下厌氧氨氧化菌活性的提升，在适温条件下，高盐度不利于厌氧氨氧化工艺的稳定运行。针对高盐环境中，污泥生物量对厌氧氨氧化菌是否有缓解作用进行研究，结果见图3。

图3 不同生物量厌氧氨氧化颗粒污泥受盐度冲击时的变化情况Fig.3 Nitrogen removal performance of granular sludge with different biomass under impact of salinity

由图3 可见，不同生物量的厌氧氨氧化颗粒污泥对盐度冲击的响应不同，C1~C4 在高盐度环境（10 g/L）下均受到抑制。特别地，当C1 受到>5 g/L的 盐 度 冲 击 时，NH4+−N 和NO2−−N 的 降 解 速 率 分 别降至0.037、0.046 kg/（kg·d），降解情况与2.1 中低盐度的促进作用不同，推测可能是由于低生物量对较高盐度梯度耐受性更差。当进水盐度增至20 g/L时，NH4+−N 和NO2−−N 降 解 速 率 的斜率未随 盐 度 的增加而进一步下降，鉴于SAA 较低，分析认为盐度为15 g/L 时对C1 已造成相当程度的抑制。

此外，在高盐度冲击下低生物量反应器的化学计量比 显著改变。与其他反应器相比，C1 的ΔNO2−−N∶ΔNH4+−N（Rs）随盐度冲击强度的增加波动幅度变大，特别对于15 g/L 以上的盐度冲击，Rs 迅速增至1.41，偏离稳态值。这可能是由于盐度快速变化导致可溶性有机碳和氨氮增加，促使反硝化过量消耗亚硝酸盐。

实验过程中，生物量对盐度胁迫下的厌氧氨氧化颗粒污泥具有缓冲效应，盐度对厌氧氨氧化颗粒污泥的抑制程度随生物量的增加而降低。Jiachun YANG等〔10〕研究指出，当生物量高于10 g/L，厌氧氨氧化污泥的适应期更短，这可能是C4 相对C1~C3 活性更高的原因。由图3（d）可见，不同生物量下SAA 随盐度的变化规律相似。当单位生物量盐度为1.8 kg/kg 左右时，C1~C4 的SAA 降至初始值的50%；当单位生物量盐度增至2.5 kg/kg 时，C1~C4 的SAA 仅为初始值的16.7%；随着盐度的继续提升，SAA 下降速度变缓。因此本研究中，1.8 kg/kg 为厌氧氨氧化菌保持活性的单位生物量盐度临界值。B.KARTAL 等〔4〕指出厌氧氨氧化菌对单位生物量盐度的最大耐受值为4 kg/kg（30 g/L）。

综上可知，高生物量的C4 通过降低单位污泥的盐度而增强厌氧氨氧化菌对盐度的耐受度，因而具有更稳定的脱氮性能，且当盐度梯度较高（单次盐度提升值≥5 g/L）时，基于对盐度耐受度考虑，单位生物量盐度不宜超过1.8 kg/kg。

3 结论

（1）低于5 g/L 的盐度对厌氧氨氧化反应器有正向刺激作用，盐度为9 g/L 时反应器的脱氮性能与对照组持平，盐度高于14 g/L 后对厌氧氨氧化菌产生抑制。

（2）低盐度（5 g/L）可以保证厌氧氨氧化颗粒系统的稳定运行，尤其在低温条件下，主要体现为低温和盐度冲击条件下短程反硝化能力降低，残留的亚硝氮迅速降低，硝酸盐积累量增加。

（3）厌氧氨氧化颗粒污泥对盐度冲击的耐受度与污泥生物量有关。高生物量能够缓解盐度对厌氧氨氧化菌的抑制作用。