异荭草素缓解CLP诱导的脓毒症小鼠急性肺功能损伤①

朱子贵 孟 文 贺承建 陈嘉城 姚平波 赵 红 谢婧娴 刘雨露

（南华大学附属南华医院重症医学科，衡阳 421002）

脓毒症是指机体对感染的反应失调而引起的全身性炎症反应综合征，可导致患者多器官损伤、衰竭甚至死亡。据统计，全球每年新增脓毒症病例1 900 万，死亡病例 600 万，致死率达 30% 左右［1］。其中，急性肺损伤是脓毒症引起器官损伤的常见并发症［2-4］。研究表明，多种天然药物中提取的中药成分在脓毒症急性肺损伤中具有潜在的研究价值，如大黄素、槲皮素、姜黄素等［5-7］。异荭草素是一种存在于决明子、集花龙胆、黄荆等药用植物的天然黄酮类有效成分，具有镇痛、抗炎、抗癌等生物活性，但未见异荭草素对脓毒症的有关报道［8-10］。因此，本研究旨在探讨异荭草素对CLP 诱导的脓毒症小鼠急性肺功能损伤的影响，以期为异荭草素的临床应用提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 50 只雄性SPF 级BALB/c 小鼠，体质量25~30 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011。动物实验遵循我国《实验动物福利伦理审查指南（GB/T358922018）》提出的原则与要求。

1.1.2 药物与试剂 异荭草素（纯度98.6%）购自成都植标化纯生物技术有限公司；诱导型一氧化氮（iNOS）合酶试剂盒、IL-10 试剂盒购自上海哈灵生物科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液购自美国博士德生物工程有限公司；Masson胶原染色试剂、苏木精-伊红染色试剂购自北京雷根生物技术有限公司；生理盐水、多聚甲醛购自南京高和化工有限公司；TBST 缓冲液及caspase 9、cas‑pase 3、NF-κB P65 等相关抗体购自上海艾博抗贸易有限公司；蛋白质凝胶电泳购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.1.3 主要仪器 ME104T/02 电子天平购自梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；HBS-1096C 酶标分析仪购自南京德铁实验设备有限公司；JIDI-16R 台式多用途高速冷冻离心机购自广州吉迪仪器有限公司；全身体积描记器-无创肺功能仪购自上海玉研科学仪器有限公司；Axioscope 5 显微镜购自德国蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 动物与处理 将健康小鼠随机分为5组：假手术对照组、模型组及异荭草素低（7.5 mg/kg）、中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）剂量组，每组10 只。参考文献［11］，麻醉小鼠，呈仰卧位，在腹白线中点下方0.3 cm 处剪开皮肤，将盲肠末端取出，采用4-0 号缝合线距末端1/3 处结扎，三棱针穿刺2 孔后，将盲肠轻放于腹腔并缝合，建立小鼠脓血症模型；对照组进行假手术操作，打开腹腔但未结扎及穿刺盲肠。2 h后，给药组分别腹腔注射10µl 7.5 mg/kg、15 mg/kg和30 mg/kg 异荭草素，假手术对照组及模型组给予等量生理盐水，连续7 d，1次/d。

1.2.2 体描箱检测肺功能指标 小鼠出现呼吸频率加快、寒颤、毛发耸立和活动减少等多种症状预示造模成功。造模成功12 h 后，将各组小鼠麻醉，进行气管插管，在体描箱内记录静息状态下呼吸通气量，并检测气道阻力改变、肺容积变换指标。

1.2.3 支气管肺泡灌洗液、血清、肺组织收集 将各组小鼠麻醉后，眼球取血，离心收集上清液。及时解剖，取小鼠右肺下叶，用电子天平秤湿重，于80 ℃干燥至恒重，秤干重，计算肺脏湿/干重比=［W/D，（湿重−干重）/干重×100%］。剩余肺组织一部分进行蜡块包埋，用于病理形态学观察，另一部分冻存，用冷生理盐水处理，制备10%的肺匀浆（剪取适量左肺组织称重后，按1 g组织加入9 ml PBS的比例配制，再按照每20 mg 肺组织加入150~200µl RIPA 裂解液的比例配制，在冰上用匀浆器制备成10%肺组织匀浆，4 ℃、4 000 r/min 离心20 min）用于后续组织蛋白的提取。

1.2.4 HE 染色观察肺组织 取蜡块包埋的肺组织，组织切片机切片。经水浴展平、置载玻片烘干、二甲苯脱蜡后，进行HE 染色，封片后在显微镜下观察。

1.2.5 ELISA 检测血清及肺组织炎症指标水平取1.2.3 制备的血清及肺匀浆，分别按照iNOS 试剂盒、IL-10试剂盒说明书操作，用酶标仪进行检测。

1.2.6 Western blot 检测肺组织细胞凋亡相关蛋白表达量 取1.2.3 制备的肺组织匀浆液，加入RIPA裂解液，冰浴30 min 后，离心取上清，用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，煮沸使蛋白变性，获得上样样本。采用SDS-PAGE 分离蛋白并转膜，进行脱脂奶粉封闭后，分别加入caspase 9、caspase 3和NF-κB P65等相关一抗4 ℃孵育过夜，TBST冲洗，加入二抗孵育 1 h，TBST 冲洗 3 次，ECL 显影后分析灰度值，实验重复3次。

1.2.7 Masson 染色观察肺纤维化 取出包埋处理的组织，进行组织切片，二甲苯脱蜡，高浓度到低浓度乙醇脱水，Masson 胶原染色试剂染色，二甲苯浸泡5 min，封片后在显微镜下观察结果。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行数据分析，多组数据用单因素方差分析（One-Way ANOVA），结果以表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异荭草素对小鼠急性肺功能损伤的影响 与假手术对照组相比，模型组小鼠肺组织干湿重比升高，静息通气量、气道阻力、肺容积降低（P<0.05，图1）；与模型组相比，除异荭草素低剂量组（7.5 mg/kg）差异无统计学意义外，异荭草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）剂量组小鼠肺组织干湿重比降低，静息通气量、气道阻力、肺容积升高（P<0.05，图1）。提示异荭草素能够缓解CLP 诱导的脓毒症小鼠急性肺功能损伤，随浓度升高，缓解作用增强，有一定剂量依赖性。

图1 异荭草素对小鼠急性肺功能损伤的影响Fig.1 Effects of isoorientin on acute lung injury in mice

2.2 异荭草素对小鼠肺组织HE 染色的影响 假手术对照组小鼠肺组织结构清晰分明未见病理形态变化；模型组小鼠肺组织结构破坏明显，肺泡壁充血、间隔增厚，肺泡腔缩小，见炎症浸润；异荭草素低剂量组（7.5 mg/kg）的病理程度与模型组接近；异荭草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）剂量组的病理程度较轻，炎症细胞浸润区域较少，肺组织结构相对完整（图2）。提示异荭草素能够改善CLP 诱导的脓毒症小鼠肺组织病变程度，缓解肺部损伤。

图2 异荭草素对小鼠肺组织HE染色的影响（×100）Fig.2 Effects of isoorientin on HE staining of mice lung tissues（×100）

2.3 异荭草素对小鼠炎症指标水平的影响 在血清中，与假手术对照组相比，模型组炎症递质iNOS含量、免疫细胞因子IL-10含量升高；与模型组相比，除异荭草素低剂量组（7.5 mg/kg）炎症水平差异无统计学意义外，异荭草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）剂量组iNOS 含量明显降低、IL-10 明显升高（P<0.05，图3A），肺组织及血清中的指标水平相一致（P<0.05，图3B）。提示，异荭草素能够改善CLP 诱导的脓毒症小鼠的炎症程度，缓解肺组织功能损伤。

图3 异荭草素对小鼠炎症指标水平的影响Fig.3 Effects of isoorientin on levels of inflammation indicators in mice

2.4 异荭草素对小鼠肺组织凋亡相关蛋白指标表达的影响 与假手术对照组相比，模型组凋亡相关蛋白 cleaved caspase 9/caspase 9、cleaved caspase 3/caspase 3表达均明显升高；与模型组相比，除异荭草素低剂量组（7.5 mg/kg）cleaved caspase 9/caspase 9表达差异无统计学意义外，异荭草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）剂量组凋亡相关蛋白指标cleaved cas‑pase 9/caspase 9均明显降低；与模型组相比，各剂量组的cleaved caspase 3/caspase 3表达均明显降低，且有一定剂量依赖性（P<0.05，图4）。异荭草素能够缓解CLP诱导的脓毒症小鼠肺损伤程度。

图4 异荭草素对小鼠肺组织凋亡相关蛋白表达的影响Fig.4 Effects of isoorientin on expressions of apoptosisrelated proteins in mice lung tissue

2.5 异荭草素对小鼠肺组织纤维化的影响 假手术对照组小鼠肺组织肺泡结构完整，无肺泡内出血，仅有少量胶原；模型组肺泡大量出现导致正常结构消失，肺间质胶原纤维增生；异荭草素低剂量组（7.5 mg/kg）的纤维化程度与模型组接近；异荭草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）剂量组纤维化程度较轻（图5）。提示异荭草素能够缓解CLP 诱导的脓毒症小鼠肺组织纤维化的程度。

2.6 异荭草素对小鼠肺组织中NF-κB 通路相关蛋白表达的影响 与假手术对照组相比，模型组小鼠肺组织中NF-κB p-P65/P65表达明显升高；与模型组相比，除异荭草素低剂量组（7.5 mg/kg）差异无统计学意义外，异荭草素中（15 mg/kg）、高（30 mg/kg）剂量组NF-κB p-P65/P65表达明显降低（P<0.05，图6）。提示异荭草素能够缓解CLP 诱导的脓毒症小鼠肺损伤程度，其机制可能与下调NF-κB 通路相关蛋白表达有关。

图6 异荭草素对小鼠肺组织中NF-κB通路相关蛋白表达的影响Fig.6 Effects of isoorientin on NF-κB pathway related protein expressions in mice lung tissue

3 讨论

据统计，脓毒症病情来势迅猛并持续恶化，超过40%的患者会出现急性肺损伤并发症，具有炎症及血管通透性增加的特点，引起严重的免疫紊乱、肺水肿、感染性休克等症状，严重威胁患者生命［12］。因此，针对脓毒症引起的急性肺损伤的特异性药物研究具有重要意义。

异荭草素是一种天然黄酮类有效成分，具有广泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗纤维化、抗癌等。其中，YUAN 等［13］研究表明，异荭草素提高小胶质细胞活力，阻断iNOS 和COX-2 蛋白表达，并降低NO 及促炎细胞因子（包括TNF-α 和IL-1β）的产生来减轻神经炎症；FAN 等［14］报道指出，异荭草素通过激活SIRT1/SIRT6/Nrf2 通路，抑制氧化应激和细胞凋亡，从而减轻顺铂诱导的肾毒性；LIN 等［15］研究显示异荭草素通过调节NF-κB 和TGF-β1/Smad信号通路缓解CCl₄诱导的大鼠肝纤维化。但未见异荭草素对脓毒症引起的急性肺损伤的影响。因此，本研究探讨异荭草素对CLP 诱导的脓毒症小鼠急性肺功能损伤及免疫紊乱的影响。

肺功能检查是呼吸系统疾病不可或缺的检查，广泛用于疾病诊断、预后评估等，具有重要临床意义［16］。肺组织干/湿重比（W/D）是血管外肺水测定的常用方法，通常反映肺水肿程度。LIU 等［17］研究表明，远志皂苷通过降低肺组织W/D，降低血清TNF-α 和 IL-1β 水平，缓解肺组织的病理程度，减轻CLP 诱导的肺损伤。本研究显示，异荭草素各组静息通气量、气道阻力、肺容积升高，肺组织W/D、炎症指标降低，炎症浸润区域较少，肺组织的病变程度减轻，提示异荭草素能缓解CLP 诱导的脓毒症小鼠急性肺功能损伤，与上述研究一致。

肺纤维化是脓毒症急性肺损伤的重要原因之一，肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，即正常肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常［18］。因此，降低肺纤维化程度能有效缓解脓毒症诱导的急性肺损伤。异荭草素在小鼠肺纤维化中的研究未见报道，因此，本研究通过建立脓毒症急性肺损伤模型并检测肺纤维化程度，结果发现，经异荭草素处理后的小鼠肺纤维化程度得到显著改善。

IL-10 是一种由细胞克隆产生的免疫性细胞因子，结合其受体发挥生物学功能，能够抑制单核巨噬细胞释放TNF-α、IL-6 等炎症递质，还能促进抗炎因子IL-1 受体拮抗剂等的释放［19］。此外，脓毒症能够诱导细胞凋亡致使组织器官功能障碍及免疫抑制，而细胞凋亡主要依赖半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族完成，因此，caspase 在脓毒症的发生发展中起重要作用［20］。其中caspase 9 作用于凋亡的内源性途径。凋亡内在途径又称线粒体凋亡途径，可通过细胞应激促进线粒体释放细胞色素C并与相关凋亡蛋白酶、ATP、caspase 9组成凋亡小体，导致caspase 3活化，作用于死亡底物，进一步促使细胞凋亡［21］。ZHANG等［22］研究显示，青蒿琥酯通过降低caspase 3、TNF-α和IL-6表达，缓解肺组织的病理程度，从而改善脓毒症诱导的急性肺损伤。LAN 等［23］报道指出，红景天苷能降低CLP 脓毒症小鼠血清TNF-α、IL-6、NO 产生，下调 iNOS 和磷酸化的 NF-κB P65 蛋白表达，缓解病情发展。本研究显示，异荭草素各组IL-10含量升高，凋亡相关蛋白表达（cleaved caspase 9/caspase 9、cleaved caspase 3/caspase 3）及NF-κB通路相关蛋白表达量（p-P65/P65）均降低，与上述研究一致。

综上，异荭草素能够缓解CLP 诱导的脓毒症小鼠急性肺功能损伤，其机制可能与抑制炎症递质、NF-κB通路蛋白磷酸化及下调凋亡相关蛋白表达有关。后续实验将计划进一步探究异荭草素改善脓毒症急性肺损伤小鼠的作用机制。