基于Caspase-1 细胞焦亡信号通路探讨栀子苷对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症的抑制作用①

游丽娇 杨小芳 耿 欢 孟佳磊 马宇慧 雷 鸣 王韫瑾

（上海中医药大学附属第七人民医院重症医学科，上海 200137）

栀子始载于《神农本草经》，列为中品，性寒，味苦，归心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效，临床应用广泛，主要有效成分包括栀子苷、藏红花素、绿原酸等［1］。其中最主要活性成分栀子苷具有抗炎、镇痛、抗内毒素、保肝利胆、抗氧化、脑缺血保护、降血压、抗糖尿病等多种药理作用［2］。细菌感染导致的全身炎症反应综合征（sys‑temic inflammatory response syndrome，SIRS）、脓毒症、感染性休克等是临床危急重症，抗感染、减轻炎症反应是救治的基础，中药抗菌、抗炎作用因抗生素的毒副作用及耐药性受到重视，常用中药制剂，如清开灵、热毒宁注射液和安宫牛黄丸等，均含有栀子，其在感染性疾病方面的应用受到广泛重视。研究对栀子及栀子苷的抗炎作用与机制进行了广泛研究，包括通过调节炎症细胞因子水平发挥抗感染及免疫调节作用，证实其可通过TLR4/NF-κB 信号途径和MAPK/ERK 信号通路发挥炎症调节作用［3-4］。

胱天蛋白酶1（Caspase-1）除参与炎症调控外，其通过炎症介导的细胞焦亡途径是经典细胞焦亡途径，细菌、病毒侵袭机体时，被天然免疫受体Caspase-1识别，Caspase-1剪切Gasdermin D（GSDMD）蛋白，释放打孔膜活性，执行细胞焦亡，引发炎症反应，诱导炎症因子释放，产生炎症性损伤［5-6］。脂多糖（LPS）是一种常见的内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁外膜结构的重要组成部分，革兰氏阴性杆菌是引起SIRS、脓毒症、感染性休克的常见病因［7］。机体受细菌病毒侵袭时往往最先驱动免疫保护，即作为先天免疫细胞的巨噬细胞［8］。在调控炎症反应方面，其中心细胞是激活的巨噬细胞，由巨噬细胞产生并释放多种炎症因子。以LPS 介导的巨噬细胞RAW264.7 作为研究靶点，通过中药单体的抗炎机制可进一步了解炎症反应的作用机制并找到有效防治策略［9］。本研究以 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞为主要炎症模型，观察栀子苷对LPS 诱导的RAW264.7 细胞的影响，同时检测Caspase-1 细胞焦亡信号通路中关键蛋白及其下游炎症因子表达和分泌情况，进一步阐明栀子苷抗炎作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 RAW264.7 细胞株（上海中科院细胞库）；栀子苷（成都普菲德，批号：19101705）；地塞米松（罗恩，批号：R010148）；LPS 粉末（Sigma 公司，O111：B4）；DMEM 培养基（批号：MA0212）、胎牛血清（FBS，批号：PWL001）、CCK-8 试剂盒（批号：MAO218）、DAPI（批号：MB3204）和蛋白酶抑制剂PMSF（批号：MA0001）均购自大连美仑生物；LDH试剂盒（上海翊圣，批号：40209）；PI 试剂盒（BD 公司，批 号 ：556547）；小 鼠 IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒（达科为，批号：1210122、E04609m、217202、1210602）；BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo，批号：23227）；兔抗NLRP3 单克隆抗体、鼠抗IL-1β单克隆抗体、兔抗IL-18 单克隆抗体、兔抗β-actin（CST，批号：15101S、12703S、57058S、8457S）；兔抗GSDMD 单克隆抗体、兔抗Caspase-1 单克隆抗体（Abcam，批号：ab219800、ab179515）；ECL 化学发光试剂盒（上海雅酶，批号：014711000）；仪器显微镜（德国徕卡）；CO2培养箱（美国赛默飞）；超净工作台（美国Thermo Scientific 公司）；纯水仪（美国Milli‑pore 公司）；多功能酶标仪（美国Molecular devices公司，MQ05267）；电泳仪和转膜仪（美国Bio-Rad公司）；Amersham Imager 600 蛋白成像仪（美国GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%FBS 的DMEM 培养基于37 ℃、5%CO2培养RAW264.7细胞。

1.2.2 CCK-8 检测栀子苷对RAW264.7 细胞存活率的影响 细胞以2.5×104个/ml 铺于96 孔板，每组设3 个复孔，加入0、2.5、5、10、20、40、80、160 µmol/L栀子苷处理24 h，采用CCK-8 试剂盒检测细胞存活率（%）=（检测孔OD 值−本底OD 值）/（对照组OD 值−空白孔OD值）×100%。选择不影响细胞存活率的浓度为最大浓度，并以此浓度按倍数稀释中、低浓度。

1.2.3 乳酸脱氢酶（LDH）释放检测 将细胞按5×103个/孔铺于 96 孔板，200 µl/孔加入完全培养基培养24 h，倒掉完全培养基，加入新鲜的无血清培养基，过夜后分为对照组、模型组、栀子苷组和地塞米松组。对照组加入基础培养基（无血清），模型组给予含10 µg/ml LPS 的基础培养基，栀子苷低、中、高浓度组和地塞米松组（5 µmol/L）于造模后1 h 给药（200 µl/孔），处理24 h 后按试剂盒说明检测，每组设3个复孔。

1.2.4 细胞上清中炎症因子分泌水平检测 按1.2.3 进行细胞分组处理，加药24 h 后取细胞上清，ELISA 试剂盒分别检测细胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6分泌，每组设3个复孔。

1.2.5 PI 染色观察细胞焦亡 参照文献［10］，细胞按1.0×105个/孔铺于24 孔板（1 ml/孔），分组及处理方式同1.2.3，细胞加药处理24 h 后（避光操作），PBS 洗 2 遍，1 ml/孔加入 PBS（含 1∶1 000 DAPI 和1∶20 PI）室温避光孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察，拍照记录。

1.2.6 Western blot 检测Caspase-1 细胞焦亡通路蛋白表达 细胞以 4.0×105个/孔接种于 6 孔板（2 ml/孔），按1.2.3 分组，加药处理24 h 后，4 ℃下PBS洗2遍，加入RIPA（100µl/孔）和PMSF（1µl/孔）冰上裂解30 min 后收集，4 ℃离心15 min 后取上清，BCA 蛋白定量，95 ℃ 5 min 蛋白变性、SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭1 h 后分别加入一抗稀释液稀释后的抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后加二抗室温孵育，显影，Image J软件处理蛋白灰度值，得出相对蛋白表达。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0 软件分析数据，数据以表示，单因素方差分析比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞存活率 CCK-8 显示，栀子苷160µmol/L组细胞存活率低于对照组（P<0.05），故选择80 µmol/L 作为栀子苷高浓度组，按倍数稀释计算中浓度为40µmol/L，低浓度为20µmol/L（图1）。

图1 栀子苷对RAW264.7细胞存活率的影响Fig.1 Effect of Geniposide on survival rate of RAW264.7 cells

2.2 栀子苷对LPS 诱导的RAW264.7 细胞LDH 释放的影响 与正常对照组相比，LPS 组细胞LDH 释放量显著增加（P<0.01）；栀子苷各浓度组和地塞米松组可有效降低细胞上清中LDH释放（P<0.01，图2）。

图2 栀子苷对LPS 诱导的RAW264.7 细胞LDH 释放的影响Fig.2 Effect of Geniposide on LDH release in LPS induced RAW264.7 cells

2.3 栀子苷对LPS 诱导的RAW264.7 细胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α 和 IL-6 分泌的影响 与对照组相比，LPS 组细胞上清中 IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6水平上调（P<0.01），栀子苷各浓度组和地塞米松组IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6 水平均低于模型组（P<0.05，P<0.01，表1）。

表1 栀子苷对LPS诱导的RAW264.7细胞上清中炎症因子的影响（，n=3，pg/ml）Tab.1 Effects of Geniposide on inflammatory factors in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3，pg/ml）

表1 栀子苷对LPS诱导的RAW264.7细胞上清中炎症因子的影响（，n=3，pg/ml）Tab.1 Effects of Geniposide on inflammatory factors in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P<0.01；compared with LPS group，2）P<0.05，3）P<0.01.

IL-6 39.53±14.34 577.01±24.691）413.06±48.522）258.33±45.392）99.54±32.943）162.70±31.103）Groups Control LPS Gen 20µmol/L Gen 40µmol/L Gen 80µmol/L Dex 5µmol/L IL-1β 26.00±3.92 80.89±0.951）35.43±2.983）34.16±0.383）32.97±3.283）44.93±3.083）IL-18 32.55±2.06 145.19±5.891）77.51±7.013）75.83±9.783）61.96±5.903）72.27±4.023）TNF-α 55.84±0.51 361.05±13.441）171.68±2.442）102.22±0.363）74.87±0.963）122.15±3.183）

2.4 PI 染色检测栀子苷对LPS 诱导的RAW264.7细胞的影响 与对照组相比，LPS 组被PI 染色的细胞核明显增多，栀子苷各浓度组和地塞米松组中PI染色数显著减少（图3）。

图3 PI 染色检测栀子苷对LPS 诱导的RAW264.7 细胞的影响Fig.3 PI staining to detect effect of Geniposide on RAW264.7 cells induced by LPS

2.5 栀子苷对LPS 诱导的RAW264.7 细胞经典细胞焦亡通路中蛋白表达的影响 与对照组相比，LPS组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18 表达显著增加（P<0.01）；与LPS 组相比，栀子苷组和地塞米松组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β 和IL-18 表达显著降低（P<0.01，图4、表2）。

表2 栀子苷对LPS诱导的RAW264.7细胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表达的影响（，n=3）Tab.2 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3，Caspase-1，GSDMD，GSDMD-NT，IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3）

表2 栀子苷对LPS诱导的RAW264.7细胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表达的影响（，n=3）Tab.2 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3，Caspase-1，GSDMD，GSDMD-NT，IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3）

Note：Compared with control group，1）P<0.01；compared with LPS group，2）P<0.01.

IL-18 0.420±0.105 0.984±0.0541）0.882±0.110 0.749±0.0282）0.335±0.0732）0.325±0.0862）Groups Control LPS Gen 20µmol/L Gen 40µmol/L Gen 80µmol/L Dex 5µmol/L NLRP3 0.091±0.035 1.250±0.0641）0.364±0.0732）0.145±0.0332）0.106±0.0172）0.101±0.0312）Caspase-1 0.293±0.002 1.334±0.0651）1.067±0.041 0.450±0.0102）0.298±0.0312）0.302±0.0212）Caspase-1 P10 0.593±0.096 1.301±0.0621）1.192±0.032 1.051±0.030 0.845±0.0182）0.302±0.0212）GSDMD 0.228±0.038 1.230±0.0901）0.678±0.1152）0.603±0.0172）0.334±0.0512）0.264±0.0452）GSDMD-NT 0.127±0.011 1.142±0.0911）0.461±0.2332）0.387±0.0702）0.198±0.0582）0.146±0.0872）IL-1β 0.726±0.060 1.080±0.0201）0.826±0.0362）0.776±0.0432）0.746±0.0162）0.738±0.0982）

图4 栀子苷对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β 和 IL-18表达的影响Fig.4 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3，Caspase-1，GSDMD，GSDMD-NT，IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS

3 讨论

脓毒症是感染引起宿主反应失调、危及生命的症候群，其本质是感染引起的SIRS，炎症反应具有“细胞因子风暴”式级联反应特征，可导致循环、细胞和代谢异常，病死率显著提高，即感染性休克；早期治疗除抗感染外，发现及阻断炎症反应也是重要的救治措施，使体内炎症反应恢复平稳，其治疗方式包括激素、抗生素及中药制剂，中药不影响抗菌药物对细菌的消除作用，且副作用少，是目前临床关注热点［11-13］。

中医将脓毒症等归为“外感热病”“脱证”“神昏”等范畴，由于邪之所凑，其气必虚，外邪入侵，入里化热，毒邪内蕴，络脉气血运行不畅，导致毒热、瘀血、痰浊内阻，瘀阻脉络，进而令各脏器损伤，因此临床多以清热解毒、通腑泄热、活血凉血及扶正固本为主［11，14］。指南推荐用于脓毒症毒热证的中成药，如热毒宁注射液、清开灵注射液、醒脑静注射液和安宫牛黄丸等，均为含栀子成分产品，栀子作为清热解毒、凉血泻火中药受到临床广泛认可［9］。

栀子苷是栀子主要活性成分环烯醚萜类化合物的代表，其含量最高，可达3%~5%［1］。药理研究证实栀子苷可能通过与Lipid A 结合中和LPS 活性，抑制LPS介导的细胞活化，减少细胞因子释放，进而保护脓毒症模型小鼠［15］。栀子苷通过糖皮质激素受体对LPS 诱导的脓毒症小鼠具有保护作用，能够改善脓毒症小鼠皮质醇异常增高现象，调节糖皮质激素下游基因表达［16］。栀子苷可降低促炎因子，IL-1β、IL-4、IL-5、TNF-α、IL-8、细胞黏附分子（VCAM-1）等表达，提高IL-10等抗炎因子水平，并能激活T细胞，促进T细胞增殖，降低细胞前炎症因子释放，发挥免疫-炎症调节效应［3-4］。

当内毒素侵入人体，识别病原相关分子受体和危险相关分子受体并通过衔接蛋白方式与胞质蛋白复合体-NLRP3 炎症小体结合，NLRP3 炎症小体是激活 Caspase-1 的胞质传感器［17］。Caspase-1 一旦被激活，会将Pro-IL-1β和Pro-IL-18分解为具有生物活性的成熟形态（IL-1β 和 IL-18），同时被激活的Caspase-1 切割为 GSDMD，剪切出 GSDMD 的氮端（GSDMD-NT）聚集至细胞膜，形成细胞膜孔隙，导致炎症因子由此空隙释放和最终死亡，是焦亡的经典途径［18-19］。焦亡的过度激活可能是导致脓毒症、感染性休克重要机制之一，LPS 是激活Caspase-1 的重要模式分子，LPS 可激活细胞质Lipid A，从而激活Caspase-1，使其表达增加，从而引发焦亡［20］。因而阻断Caspase-1 细胞焦亡信号通路可阻断炎症反应及焦亡，从而减轻炎症反应导致的损伤，有利于脓毒症等控制。

LPS 刺激 RAW264.7 细胞后，通过 LDH 释放和PI 染色观察细胞死亡情况，结果显示模型组细胞LDH 释放量和PI摄取明显高于正常对照组，而栀子苷各组均显著减少了LDH 释放和PI 摄取，且在LPS诱导下，NLRP3炎症小体和Caspase-1细胞焦亡信号通路上的关键蛋白及其下游蛋白表达明显升高，细胞上清中炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6 明显上调，表明LPS 激活了Caspase-1 细胞焦亡的信号通路。栀子苷各组抑制了NLRP3炎症小体和Caspase-1细胞焦亡信号通路上的关键蛋白及其下游蛋白表达，且减少了炎症因子 IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6分泌，说明栀子苷对Caspase-1细胞焦亡信号通路具有抑制作用。

综上所述，栀子苷可能通过下调NLRP3 炎症小体表达，从而抑制Caspase-1 细胞焦亡信号通路激活，进一步减少炎症因子释放和细胞死亡，故栀子苷为临床炎症性疾病治疗提供了新思路，值得进一步研究。