辐照协同甲酸法分离南荻纤维素及其酶解性状分析

王丹阳 武小芬 齐 慧 陈 亮 刘 安 邓 明 王克勤,

1（湖南大学研究生院隆平分院 长沙 410125）

2（湖南省农业科学院 湖南省核农学与航天育种研究所农业生物辐照工程技术研究中心 长沙 410125）

南荻（Triarrhena lutarioripariaL.Liu）为禾本科多年生C4草本植物，其纤维素含量达32.5%～53.9%，是我国特有物种［1］。截至2017 年底，洞庭湖区南荻年产量达91.03×107kg，占全国总产量的30%以上，该资源多用于制浆造纸行业［2］。伴随着洞庭湖水污染问题，制浆和造纸产能于2019 年全面退出。为充分利用湖区南荻资源，近年来科研人员重点探索研究南荻规模化制燃料乙醇、生物质发电、新兴绿色环保建材等产业链［3-5］。

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中纤维素组成的微细纤维构成了纤维细胞壁的骨架，木质素和半纤维素等则作为微细纤维间的“胶黏剂”和“填充剂”，通过分子链的相互缠绕及部分氢键和化学键的相互结合，组成了结构复杂且紧密的纤维细胞壁结构［6］。酶解是纤维乙醇转化过程的关键环节［7］。由于木质纤维素结构的复杂性，导致各组分之间难以分离，为更好地利用木质纤维素，对原材料进行预处理是必要的［8-9］。

常用的木质纤维素预处理方法有碱法、酸法、蒸汽爆破法、生物酶解法等［10］。而强酸强碱存在腐蚀设备、溶剂回收等问题，高温高压存在能耗大、成本高等问题［11］。生物酶解法其周期长、效率低［12］。作为价格低廉、回收率高、绿色环保的有机溶剂，甲酸被广泛用于木质纤维素的预处理［13］。辐照技术作为绿色无污染的预处理手段颇受欢迎，辐照降解后样品的分子量、机械强度和热稳定性降低了，且在溶剂中的溶解度增加［14］。本试验采用辐照协同甲酸法分离南荻木质纤维素，旨在获得高纯度的南荻纤维素，并对其进行酶解。此外，对南荻纤维素进行结构分析，为南荻木质纤维素规模化制燃料乙醇提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料南荻收割于洞庭湖，自然晒干后，置于阴凉干燥处备用。甲酸，质量分数88%，分析纯，衡阳市凯信化工试剂股份有限公司；硫酸，质量分数98%，分析纯，成都市科隆化学有限公司；乙酸、三水合乙酸钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；D-无水葡萄糖、D-木糖、D-纤维二塘、L-阿拉伯糖，均为分析纯，Sigma-aldrich 公司；溴化钾，分析纯，天津天光光学仪器有限公司；纤维素酶，Cellic Ctec3，Novozymes公司。

1.2 仪器与设备

5 MeV 电子束辐照装置，河北速能辐照加工有限公司；BSA224S-CW 型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FW100 型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；YRGS 型智能磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；3GE-76 型电热恒温干燥箱、SHZ-C 型水浴恒温振荡器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DZKW-S-6 型电热恒温水浴锅，北京市光明医疗仪器有限公司；JJ-6型数显直流恒速搅拌器、功率100 W直流机，江苏金怡科技有限公司；TG16-WS 型台式高速离心机，湖南迈克尔实验仪器有限公司；RE-2000B 型旋转式蒸器，上海亚荣生化仪器厂；SHB-DIII 型循环水真空泵；郑州长城科工贸有限公司；LDZX-50KBS型立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；BlueStar A型紫外分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；UltiMate 3000型高效液相色谱仪、Nicolet iS5型傅里叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；6000 型X 射线衍射仪，日本岛津公司；HZQF100型恒温摇床，常州诺基仪器有限公司。

1.3 试验设计与方法

1.3.1南荻样品预处理

将南荻秸秆装入金属辐照箱中，于室温下采用5 MeV 电子束进行辐照处理，吸收剂量分别为200 kGy、400 kGy，以未处理的南荻秸秆（0 kGy）为对照组。辐照处理后用铡刀将其切割成0.5 cm×1.0 cm 左右的块状，如图1 所示。相较于粉末状，原料采用块状南荻秸秆，减少了物理粉碎的能耗，缩短了反应后的过滤时长，且更贴合工业化处理情况。

图1 不同吸收剂量的块状南荻秸秆外观Fig.1 Different absorbed doses of dioscorea Triarrhena lutarioriparia

1.3.2 南荻秸秆化学成分分析

南荻可溶性葡聚糖含量、可溶性木聚糖含量、酸不溶性木质素含量、酸溶性木质素含量、纤维素含量、半纤维素含量的测定，参照NREL法［15］。

具体操作：原料粉碎后过孔径为0.45 mm 的筛网，称取3.0 g 过筛样品于三角瓶中，按固液比1∶30加入蒸馏水，于50 ℃、130 r/min震荡反应2 h进行水洗处理，反应后过滤，收集滤液，测定葡萄糖、木糖含量；取滤液20 mL 加入质量分数72%硫酸溶液0.715 mL，121 ℃反应1 h 后，测定葡萄糖、木糖含量；水洗滤渣于105 ℃烘至恒重后，收集于自封袋中备用。

两步酸水解：称取0.3 g 水洗滤渣至三角瓶中，加入质量分数72%硫酸溶液3 mL，于30 ℃水浴反应1 h，反应结束后加入84 mL 蒸馏水，置于高压蒸汽灭菌锅121 ℃反应1 h。反应结束后过滤，收集滤液稀释适当倍数后于320 nm处测吸光度，并测定滤液中葡萄糖、木糖含量。滤渣于105 ℃烘至恒重，测得酸不溶性木质素重量。

葡萄糖、木糖含量测定：取滤液过0.45 μm 滤膜，采用高效液相色谱法（HPLC）测定葡萄糖、木糖含量，流动相为0.005 mol/L 的硫酸，流速0.6 mL/min；色谱柱Bio Rad Aminex HPX-87H（7.8×300 mm），柱温55 ℃，柱后冷却温度30 ℃，示差折光检测器（RI），检测器温度45 ℃，进样体积10 μL。

1.3.3 辐照协同甲酸法分离南荻木质纤维素及各组分分析

称取25.0 g 块状南荻秸秆于三颈烧瓶中，固液比1∶10加入甲酸溶液，在一定温度下反应2 h，反应结束后抽滤，滤渣水洗至中性，且烘干后粉碎过孔径为0.45 mm 的筛网，即南荻纤维素；滤液在60 ℃下旋蒸至近干，加入蒸馏水析出木质素，将其抽滤，滤渣烘干后经研钵研磨，为南荻木质素，滤液为木糖溶液［16］。参照§1.3.2 中两步酸水解对各组分含量进行测定。综合文献信息，反应温度、甲酸浓度、吸收剂量对木质纤维素的分离有较大的影响，故以此为研究因素，进行三因素三水平的正交实验优化南荻纤维素的分离条件。正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

通过式（1）计算各组分中纤维素提取率，式（2）计算木质素提取率。

式中：Ecel代表纤维素提取率；pcel−tl代表南荻纤维素纯度；mcel−tl代表南荻纤维素干重，g；mtl代表原料南荻干重，g；ctl-cel代表原料南荻的纤维素含量；Elig代表木质素提取率；plig-tl代表南荻木质素纯度；mlig-tl代表南荻木质素干重，g；ctl-lig代表原料南荻的木质素含量。

1.3.4 南荻纤维素酶解反应

酶活测定：称取50 mg 滤纸碎片加入稀释后的酶液0.5 mL、pH 为4.8 的乙酸-乙酸钠缓冲液1 mL，50 ℃酶解反应1 h，取出，沸水浴5 min，终止反应；取酶解上清液，稀释至合适倍数后，采用HPLC测定酶解液中葡萄糖的含量。根据在酶的催化作用下，每分钟形成1 μmol 葡萄糖时所用该酶的量作为一个酶活国际单位，测得纤维素酶活为115 FPU/mL［17］。

纤维素酶解转化率测定：称取样品2.0 g，按固液比1∶10 加入pH 为4.8 的乙酸-乙酸钠缓冲液，纤维素酶添加量为15 FPU/g，置于转速130 r/min，50 ℃恒温摇床进行酶解，每隔24 h 取其上清液0.3 mL，离心后稀释10 倍，HPLC 测定葡萄糖含量，按式（3）计算纤维素酶解转化率。

式中：Tcel为纤维素酶解转化率；mglu为葡萄糖质量，g；m为样品干重，g；ccel为样品纤维素含量。

1.3.5 南荻纤维素结构分析

傅里叶红外光谱（FTIR）分析：取适量经60 ℃干燥至恒重的样品与干燥后溴化钾（KBr）均匀混合后，研磨、压片，扫描次数为32 次，测量范围为400～4 000 cm−1。

X射线衍射（XDR）分析：取适量经60 ℃干燥至恒重的样品用于X 衍射测定结晶度，条件为Cu 靶，管压40 kV，电流40 mA，扫描范围5°～50°，扫描速度6(°)/min，根据式（4）计算样品的结晶度。

式中：Xc为纤维素结晶度；I1为主结晶峰的最大衍射强度；I2为无定形区衍射峰的衍射强度。

1.4 数据处理

采用SPSS 19和Microsoft Excel 2010分析整理数据；Origin 2021制图。

2 结果与讨论

2.1 辐照前后南荻秸秆的主要化学成分分析

由表2可知，未辐照南荻秸秆纤维素、半纤维素和酸不溶性木质素含量分别为41.73%、18.79%和25.55%。随着吸收剂量的增加，南荻秸秆纤维素和半纤维素含量显著下降；可溶性葡聚糖、木聚糖含量随吸收剂量的升高而显著增加，酸溶性木质素含量也呈增加趋势，说明了辐照处理后纤维素、半纤维素等成分降解为小分子糖。张勇等［18］研究辐照对玉米秸秆成分的影响时也得到类似的结论，且木质纤维素的降解是典型的固体界面催化，辐照处理能破坏木质纤维素相互交联的紧密结构，使其变得疏松，从而更利于后续甲酸与纤维素底物的接触，促进纤维素、木质素和半纤维素的分离。

表2 辐照处理对南荻组分含量的影响Table 2 Effect of irradiation on the content of Triarrhena lutarioriparia components (%)

2.2 辐照协同甲酸法分离南荻纤维素的工艺优化

2.2.1 正交试验结果

以温度、甲酸浓度和吸收剂量为研究因素，以南荻纤维素纯度为指标，进行三因素三水平的正交试验，结果如表3 和表4 所示。由表4 分析可知，温度、甲酸浓度和吸收剂量对南荻纤维素纯度均有显著性影响，其中甲酸浓度对纤维素纯度影响最大，甲酸浓度的提高有助于木质素与半纤维素的溶解，从而使纤维素纯度增加［19］；吸收剂量次之，辐照处理后半纤维素含量明显降低，由表3 L9（33）正交试验表可知，C 因素1 水平0 kGy 仅为甲酸处理组，C因素2、3（经200 kGy、400 kGy 辐照处理）水平下的纤维素纯度均值分别为64.927%、64.653%，明显高于1 水平的纤维素纯度均值59.567%。温度对纤维素纯度的影响稍弱于吸收剂量，高温下可使半纤维素与木质素的溶解速率加快。由表3可知，其最佳的分离条件为A3B3C2，即南荻秸秆在吸收剂量为200 kGy、在110 ℃下经88%甲酸处理2 h。

表3 L9(33)正交试验表Table 3 Test designs of L9(33)orthogonal experiments

表4 正交实验因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiments

2.2.2 工艺验证

对§2.2.1中正交试验筛选的最优工艺条件进行验证。从表5可知，辐照协同甲酸处理所得南荻纤维素的提取率达92.99%、纯度达73.26%，除纤维素外还含有少量的半纤维素和木质素成分。分离所得南荻木质素的提取率达61.46%、纯度达81.29%，另外，还含有少量纤维素和半纤维素成分。综合分析认为该工艺条件有利于南荻木质纤维素组分的分离，以下所述的辐照协同甲酸处理所得纤维素均按此工艺从200 kGy辐照南荻秸秆中分离获得。

表5 辐照协同甲酸处理所得纤维素和木质素成分分析Table 5 Component analysis of cellulose and lignin fractionate by irradiation-assisted formic method (%)

2.3 南荻纤维素结构分析

2.3.1 FTIR光谱分析

图2 为不同处理南荻纤维素红外光谱图，3 390 cm−1特征峰是羟基O−H 伸缩振动；2 920 cm−1特征峰是亚甲基、次甲基C−H伸缩振动；1 725 cm−1特征峰是醛官能团C=O伸缩振动，其主要由半纤维素中的特征基团引起的；1 640 cm−1特征峰是吸附水H−O−H 弯曲振动；1 513 cm−1特征峰是苯环伸缩振动，为木质素的特征峰；1 427 cm−1、1 377 cm−1、1 248 cm−1分别是纤维素−CH2对称弯曲振动、−CH2弯曲振动、C−C−H 变形振动；1 161 cm−1特征峰是C−O−C不对称伸缩振动，为纤维素超分子链上的主要结合键；1 050 cm−1特征峰是纤维素C=O 伸缩振动；898 cm−1是β-1，4糖苷键的特征峰［20−22］。

图2 不同处理所得南荻纤维素FTIR图Fig.2 FTIR spectra of Triarrhena lutarioriparia cellulose obtained by different treatments

200 kGy 辐照处理所得的南荻纤维素，在波数3 390 cm−1、2 920 cm−1、1 427 cm−1、1 377 cm−1处的峰吸收强度降低，说明200 kGy南荻秸秆中羟基、甲基和次亚甲基含量降低，即辐照对纤维素有一定的降解作用；在波数1 725 cm−1处的振动减少，其主要由半纤维素降解引起；此结果与胡蝶等［23］对辐照后芒草的结构变化相一致。此外通过1 427 cm−1处和898 cm−1处的吸光度之比（A1430/A898）可知，经辐照处理后纤维素的结晶度降低了。

辐照协同甲酸处理所得的南荻纤维素，在波数3 390 cm−1、2 920 cm−1处的峰吸收强度较大，说明甲酸对纤维素的降解程度较低；在波数1 725 cm−1、1 513 cm−1处的振动减少，说明经甲酸处理后有效地去除了半纤维素和木质素组分，即辐照协同甲酸适用于南荻木质纤维素的分离；武小芬等［24］的研究也表明甲酸有利于稻草木质纤维素的分离。

2.3.2 XRD分析

由图3可知，辐照及辐照协同甲酸处理后，2θ衍射角为16.5º、22.0º、34.5º处的衍射峰位置未发生变化，说明辐照及辐照协同甲酸处理未改变纤维素晶型，均为Ⅰ型结构［25］。经计算未辐照南荻秸秆、200 kGy 南荻秸秆、辐照协同甲酸处理所得的南荻纤维素的结晶度分别为55.43%、52.46%、59.92%。相对于0 kGy南荻秸秆，200 kGy南荻秸秆的结晶度有所下降，南荻秸秆经辐照后产生自由基，自由基位阻大，导致具有半刚性的纤维素分子链发生断裂解聚，使纤维素结晶度下降，这与Fei等［26］的研究结果一致；相对于未经辐照处理的南荻秸秆，辐照协同甲酸处理所得纤维素结晶度升高。

从图3可知，南荻秸秆经甲酸处理后其2θ衍射角为16.5º、22.0º、34.5º三处衍射峰变得尖锐。张莉等［27］研究甲酸-盐酸体系下木质纤维素的组分分离，经甲酸体系处理过的XRD峰变得特别尖锐，说明经过甲酸处理有部分结晶生成或结晶重排定向。许家云等［28］在研究甲酸法提取麦草化学组分及表征时，提出原料结晶度是整个木质纤维素的结晶度（包括纤维素、木质素、半纤维素），经甲酸处理后去除了大量的木质素和半纤维素，使纤维素的相对含量增加，故处理后结晶度增加。

图3 不同处理所得南荻纤维素XRD图Fig.3 XRD of Triarrhena lutarioriparia cellulose obtained by different treatments

2.4 南荻纤维素酶解效果

影响纤维素酶解的因素主要有纤维素酶的可及度、纤维素结晶度和聚合度、木质素含量和结构等，增加纤维素酶的可及度，降低纤维素结晶度，降低样品中木质素含量等都可以提高纤维素酶解转化率［29−30］。

从图4 可知，相比未经辐照处理的南荻秸秆，200 kGy辐照处理所得的南荻秸秆在0～24 h内纤维素酶解转化率显著提高，在48 h 后其变化较小，酶解96 h 时200 kGy 南荻秸秆的酶解转化率达到19.21%，相比于未经辐照处理的南荻秸秆提高了1.32 倍，说明辐照处理可以有效提高南荻秸秆的酶解转化率，这与陈亮等［31］的研究结果一致。从图5可知，酶解过程葡萄糖浓度也呈相同的趋势。结合FTIR 光谱及XRD 衍射分析可知，辐照处理使南荻秸秆发生了一定的降解，增加了纤维素酶的可及度。此外，辐照后纤维素结晶度降低，也可使酶解转化率进一步提高。

由图4 可知，与200 kGy 南荻秸秆相比，在0～48 h，仅辐照处理的酶解转化率高于辐照协同甲酸处理，在72～96 h，辐照协同甲酸处理的酶解转化率仍在增加，而200 kGy辐照处理的变化较小，结合图5可知，经200 kGy辐照处理的南荻秸秆在48 h时其纤维素较大程度上被酶解了，而辐照协同甲酸处理所得的纤维素组分仅酶解了一部分，故其在72～96 h的酶解转化率仍在增加，在酶解96 h时其转化率达到28.43%，较未处理南荻秸秆的转化率提高了2.43倍。通过§2.3.2 中XRD 分析可知，辐照协同甲酸处理所得的南荻纤维素结晶度高于仅辐照处理的，虽然南荻纤维素结晶度增加，影响了后续酶解效率，但结合§2.2.2中辐照协同甲酸所获纤维素组分的成分分析可知，经辐照协同甲酸处理后南获纤维素相对含量达73.26%，较未经处理的南荻原料的纤维素含量（41.73%）提高了0.76倍，且经过甲酸处理后大部分木质素被去除、半纤维素被溶解，增大了纤维素的孔隙率，进而使纤维素酶的可及度增加，故辐照协同甲酸处理后酶解转化率显著提高。

图4 不同处理所的南荻纤维素经酶解后纤维素转化率Fig.4 Cellulose conversion rate of Triarrhena lutarioriparia cellulose obtained by different treatments after enzymatic hydrolysis

图5 不同处理所得南荻纤维素经酶解后葡萄糖浓度Fig.5 Glucose concentration of Triarrhena lutarioriparia cellulose obtained by different treatments after enzymatic hydrolysis

3 结论

经正交试验分析，得到最佳分离工艺条件为：吸收剂量200 kGy、甲酸质量分数88%、油浴温度110 ℃、反应时间2 h，该条件下南荻纤维素纯度最高，达73.26%，提取率达92.99%。并对南荻纤维素进行酶解试验，在固液比1∶10、纤维素酶添加量15 FPU/g、酶解温度50 ℃、转速130 r/min 的条件下酶解96 h 后，其纤维素转化率达28.43%，较未处理原料提高了2.43倍。FITR、X射线衍射表明，辐照协同甲酸处理所得纤维素结构保存完整，处理后其结晶度明显增加。

作者贡献说明 王丹阳完成了论文中南荻木质纤维素的分离及其各组分成分的测定，实验数据处理和分析，论文的撰写和修改；武小芬完成论文的试验设计，对文章进行了修改；齐慧完成了南荻纤维素酶解反应；陈亮完成了南荻纤维素的FTIR光谱分析；刘安完成了南荻纤维素的X-射线衍射分析；邓明完成了论文中辐照前后南荻秸秆化学成分的测定；王克勤提供了本文的研究思路和试验方案，以及论文研究的经费。全体作者均已阅读并同意最终的文本。