METTL3在早期鳞状细胞宫颈癌中的表达及其与临床特征和预后的关系

王彩霞，卢 寒，周 宏，帅翰林，李玉洁

宫颈癌是全世界妇女癌症死亡的第四大原因。尽管进行了广泛的宫颈癌筛查，全球宫颈癌的发病率正在下降，但它仍然是妇女癌症相关死亡的主要原因之一。因此，探索一个新的宫颈癌诊断和预后的生物标志物对宫颈癌患者的个性化治疗至关重要。

N6 -甲基腺苷(m6A)修饰作为真核细胞中mRNA最常见的修饰之一，在基因调控过程中，如mRNA的稳定、剪接和翻译等过程中发挥着不可或缺的作用。甲基化转移酶3 (methyltransferase like 3, METTL3)作为主要的RNA腺苷甲基转移酶，参与了肿瘤的各种生物学过程。既往发现，与对照组相比，METTL3在胃癌组织中明显增加，并且METTL3的表达随着肿瘤分期和分级的进展而逐渐增加，可作为胃癌患者的一个不良预后因素。细胞实验中敲低METTL3后人胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到显著的抑制。此外，Li等发现METTL3基因可以通过PI3K/AKT途径，诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制肺癌的发展。Wang等发现，METTL3表达水平在乳腺癌组织上调，敲低METTL3可以降低mRNA甲基化水平，减少肿瘤细胞增殖，加速细胞凋亡并抑制肿瘤生长；同时发现Bcl-2可作为 METTL3 的靶点，调节乳腺肿瘤细胞的增殖和凋亡。这些结果表明，METTL3可能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡等在癌症的进展中起重要作用。然而，METTL3在鳞状细胞宫颈癌中的表达情况尚未见报道，本研究旨在探讨METTL3在早期鳞状细胞宫颈癌中的表达及其与临床特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 共纳入2008年1-12月于武警广东总队医院和暨南大学附属第一医院收治的宫颈癌患者110例，纳入标准：(1)经病理证实为FIGOⅠb1-Ⅱa(2018 FIGO分期)鳞状细胞宫颈癌患者；(2)行广泛性子宫切除术及双侧盆腔淋巴结清扫术，术前有或无辅助治疗，术后取得新鲜手术标本及相邻正常宫颈组织，癌旁正常组织为距肿瘤病灶5 cm以上的组织，经免疫组织化学染色证实； (3)既往无其他癌症病史； (4)临床资料及随访资料齐全。排除标准：(1)接受姑息性手术； (2)手术中确认有远处转移或腹膜播散。所有患者均签署知情同意书，本研究已获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法 分析METTL3在宫颈癌标本和相邻非肿瘤宫颈组织标本中的表达水平，并根据METTL3的表达水平将患者分成METTL3高/低表达组。收集临床病理资料，包括年龄、FIGO分期、肿瘤大小、淋巴血管间隙浸润、宫颈深部间质浸润、盆腔淋巴结转移，以及随访时间和生存状态，分析METTL3表达水平及其与临床病理特征预后的关系。

1.2.1 主要试剂及仪器 鼠抗人METTL3单克隆抗体购自美国 ProteintechGroup公司，免疫组化检测试剂盒及PBS缓冲液购自武汉Servicebio生物科技有限公司，DAB试剂盒购自上海碧云天公司。免疫组织化学染色方法染色步骤严格按 SP试剂盒说明书进行。

1.2.2 METTL3免疫组化检测与评定 所有石蜡包埋切片均切成厚度为 4～6 μm，在65 ℃烘箱中加热30 min后放入二甲苯中脱蜡；而后在3%的HO中进行抗原修复，冷却至室温，用免疫组化专用封闭液将切片封闭30 min；接着将切片用鼠抗人METTL3 单克隆抗体孵育4 ℃过夜。在孵二抗前将切片从冰箱拿出回温30 min，接着切片用二抗室温孵育30 min，PBS洗5 min，二氨基联苯染色5 min。染色结果按两个标准评分：(1)肿瘤细胞染色阳性比例，分为0(无)、1(1%～10%)、2(11%～50%)、3(51%～75%)、4 (76%～100%)；(2)阳性细胞平均强度，分为0(无)、1(弱)、2(中等)、3(强)。将比例分数和强度分数相乘，得到复合总分(范围0～12)。根据总分的平均数数值，将METTL3的表达水平分为高、低两组，高于平均值的为METTL3高表达组。

1.2.3 治疗方案 34例(30.3%)术前接受2～3个周期的化疗。化疗方案为紫杉醇175 mg/m，顺铂60 mg/m；每3周重复1次。术后对有盆腔淋巴结转移、切缘阳性、癌旁浸润等危险因素的病例同时加放化疗。化疗方案为顺铂40 mg/m，每周第1天，共4～5个周期。总剂量为50 Gy，每日2.0 Gy，每周5次。

1.2.4 随访方法 总生存期 (OS) 定义为从治疗到因任何原因死亡的时间。总随访时间定义为从手术日期到最后一次就诊的时间(以月为单位)，随访截至2020-06-30。

2 结 果

2.1 一般情况 在110例鳞状细胞宫颈癌患者中，52例为Ib1期，20例为Ib2期，38例为IIa期。平均年龄(45.3±10.1)岁，肿瘤平均(2.8±1.4)cm，存活患者的随访时间平均(58.6±7.9)月。

2.2 METTL3在鳞状细胞宫颈癌组织中的表达 免疫组织化学检测结果显示，鳞状细胞宫颈癌患者肿瘤样本METTL3 的表达水平(2.705±0.273)低于癌旁正常组织(8.574±0.421)，差异有统计学意义(<0.01，图1)。

2.3 鳞状细胞宫颈癌中METTL3表达与临床病理特征的关系 METTL3的低表达与较高的FIGO分期(=0.041)和盆腔淋巴结转移(=0.001)有关。METTL3的表达与其他临床病理特征之间不存在相关性(表1)。

2.4 METTL3 表达水平与鳞状细胞宫颈癌预后的关系 与METTL3 表达水平较高的患者相比，METTL3 表达水平较低的患者的总生存期 (OS)明显短(=3.576，95%CI：1.474～8.677，=0.0048)(图2)。采用Cox比例风险模型单变量生存分析显示，FIGO 分期(=5.526，95% CI: 1.315～21.791，<0.001)、盆腔淋巴结转移(=3.315, 95% CI: 1.115～9.189,=0.04) 和 METTL3 表达水平(=13.5，95% CI: 2.321～31.105，=0.001) 是早期宫颈癌患者OS的预测因子。多变量生存分析也显示了类似的结果，METTL3低表达(=6.187，95% CI: 2.314～21.292，=0.004)、FIGO分期(=5.109，95% CI: 1.891～11.135，<0.01)和盆腔淋巴结转移(=2.395, 95% CI: 1.156～4.879,=0.017)是早期鳞状细胞宫颈癌患者OS的独立影响因素(表2)。

3 讨 论

作为一种高度动态的mRNA修饰，m6A甲基化是由甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白三者共同催化的，m6A甲基化转移酶和去甲基化酶之间的相互作用在RNA剪接、蛋白质翻译等生物过程中起着关键作用。然而，m6A修饰在人类疾病，特别是癌症中的作用和临床意义才刚刚开始被探索。作为一种主要的m6A甲基化转移酶，METTL3以独立于m6A或者m6A依赖的方式发挥作用。过表达的METTL3定位于转录起始位点，不依赖于其甲基化转移酶活性的情况下增强癌基因翻译。失调的METTL3也可通过m6A修饰影响下游靶基因，促进癌症进展。例如，METTL3可以通过增加miR221表达和促进AFF4/ MYC信号网络的成熟来促进膀胱癌细胞的增殖。在白血病中，人类髓系白血病细胞系中的METTL3缺失可以诱导细胞分化和凋亡，并延缓白血病进展。在本研究中，我们发现METTL3可以在宫颈癌的进展中发挥抑癌作用，它在宫颈肿瘤组织中下调，并与不良预后相关。

本研究结果表明，METTL3在早期鳞状细胞宫颈癌中低表达，该蛋白表达的下降与较高的FIGO分期和较多的盆腔淋巴结转移相关(<0.05)。根据METTL3的表达水平是否超过平均水平，将患者分为METTL3的高表达和低表达组。与METTL3 高表达组相比，METTL3低表达组患者的总生存期(OS)明显缩短。多变量Cox分析表明FIGO分期和盆腔淋巴结转移是早期鳞状细胞宫颈癌预后不良的独立影响因素(<0.05)，同时，METTL3的低表达也是一个独立的预后因素(<0.05)。

我们推测METTL3参与的机制与其他癌症类型相似，Wu等揭示METTL3能增强致癌基因的翻译，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。Chen等报道，METTL3在人类肝细胞癌中明显上调，且与预后不良有关。敲除METTL3可大幅降低肝癌细胞在体外的增殖和迁移能力，并可显著抑制肝癌细胞的致瘤性及体内的肺转移能力。这些数据表明，METTL3可能作为一种致癌基因，参与了肿瘤的进展。最近研究发现，METTL3通过调节癌基因的翻译在多种肿瘤中发挥重要作用，敲低METTL3降低了胃癌细胞中的Bcl-2，并增加了Bax和Caspase-3的活性，这表明凋亡途径被激活。Shi等发现，METTL3在乳腺癌中低表达，并与三阴性乳腺癌的短期无转移生存密切相关，可通过降低三阴性乳腺癌细胞系中的m6A水平来增强迁移、侵袭和黏附的能力，最终促进肿瘤细胞的转移。在结肠癌中METTL3通过抑制SOCS2促进细胞增殖来维持癌细胞的致瘤性。Xia等发现，与相邻的非恶性食管黏膜组织相比，METTL3 在食管鳞状细胞癌组织中上调，并且 METTL3的较高表达水平与较低的存活率相关，METTL3 表达水平是食管鳞状细胞癌患者无病生存和总生存期的独立预测因子。这可能与METTL3通过YTHDF1/HK2修饰促进Warburg效应，通过加速糖酵解和YTHDF1/HK2轴发挥致癌因子的作用有关。在宫颈癌中，METTL3 表达与肿瘤组织中 CD33细胞的密度呈正相关，并且与患者 DFS 或 OS 缩短显著相关。研究表明，METTL3的表达与RAS癌基因家族成员之一的RAB2B的表达显著相关，RAB2B 的过表达可以显著抑制肿瘤细胞增殖，表明METTL3可以通过RAB2B的转录后修饰调控宫颈癌的恶性程度。

总之，METTL3表达水平在早期鳞状细胞宫颈癌组织中降低，FIGO分期、盆腔淋巴结转移及METTL3表达水平是早期宫颈癌患者生存不良的独立预后因素，表明METTL3可能为新的潜在预后标志物和宫颈癌的治疗靶点，但仍需要进一步研究所涉及到的分子机制及信号通路。