熊果酸固体分散体的制备与质量评价

张 领，段丽颖，武 倩

（河北省中药研究与开发重点实验室/ 承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

熊果酸（ursolic acid，UA）别名乌索酸、乌苏酸，是从杜鹃花科熊果中提取的一种五环三萜类化合物，具有抗菌[1]、护肺[2]、保肝[3]、降血糖[4]、调血脂[5]等多种生理活性，和诱导胶质瘤细胞凋亡[6]、抗脑瘤[7]、抗癌[8]、治疗重症肌无力[9]、抗增殖活性[10]的作用。另外，UA具有明显的抗氧化功能[11]，是一种较强的抗氧化剂，对人体的抗衰老、皮肤祛斑、祛色素都有积极作用。UA水溶性差，25℃时水中溶解度仅为7.16 μg/L[12]，生物利用度低。现有的提高UA溶出度和提高生物利用度的制剂技术有自微乳冻干制剂[13]、纳米脂质体[14]、固体分散体等。其中固体分散体由于工艺简单，是常用于提高药物的溶出度和生物利用度的手段之一。文献报道有关熊果酸固体分散体（ursolic acid solid dispersions，UA-SD）的研究常采用载体如泊洛沙姆188[15]、PVP K30[16]等，近年来，随着科技的发展，出现了许多新的辅料，如聚乙烯已内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus）、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）等，具有广泛的应用前景。其中，Soluplus具有良好的抑晶、增溶效果，为固体分散体的制备提供了更多选择。本课题优选新型载体材料，制备UA-SD，以提高药物的溶出度、生物利用度。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），AG-254电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），RC806溶出试验仪（天津天大天发公司），JA-2003电子天平（奥豪斯仪器有限公司），GT16-3型高速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司），SHZ-DCZZZ循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），HZQ-C气浴恒温振荡器（天坛市天竟实验仪器厂），HF型热风循环干燥箱（吴江华飞电热设备有限公司），KQ2200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），EYELA旋转蒸发仪（北京五洲东方科技发展有限公司），DSC250热分析仪（美国TA仪器），D8-Advance型X射线衍射仪（德国 Bruker公司），Nicolet380红外光谱仪（美国热电集团），Nano SEM430扫描电镜（美国FEI公司）

1.2 试剂

熊果酸原料药（宝鸡市金台区科瑞仪器经销部，批号：HU023144198），熊果酸对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：19011506），Soluplus（北京凤礼精求医药股份有限公司），TPGS（湖北鸿运隆生物科技有限公司），PVP VA64（德国BASF公司），PEG 6000（北京凤礼精求医药股份有限公司），SDS（天津市光复精细化工研究），柠檬酸（天津市标准科技有限公司），磷酸氢二钠（天津欧博凯化工有限公司），磷酸二氢钾（天津市科密欧化学试剂有限公司），氢氧化钠（天津欧博凯化工有限公司），浓盐酸（北京化工厂），甲醇（色谱纯，Fisher Technology Inc，USA），磷酸（色谱纯，Fisher Technology Inc，USA），无水乙酸钠（天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司）

2 UA的含量测定方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5-C18（150×4.6mm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水（90：10），流速为1.0 ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；检测波长：210nm。

2.2 溶液的配制

对照品溶液的配制：精密称取UA对照品约3mg，置容量瓶中，加甲醇，超声，放冷，定容，即得。

供试品溶液的配制：取样品，加入甲醇，超声，放冷，定容，即制得供试品溶液。

2.3 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液，注入HPLC测定，以峰面积对UA浓度做图，得方程：Y= 4.2989X + 2.6741，R2= 0.9994，线性范围：8~102μg/ml。

2.4 回收率实验

精密吸取2.2项下UA对照品溶液，加入处方比例辅料，用适量甲醇稀释得低、中、高3种浓度，每个浓度平行实验3次，按2.1色谱条件进行测定，计算回收率。结果显示，UA样品的回收率均在95%～105%范围内，RSD值均小于2%，符合标准。见表1。

表1 UA样品回收率

3 结果

3.1 抑晶实验

3.1.1 实验条件 选用介质为0.2%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）水溶液，900ml，温度37℃，转速50r/min，桨法。

3.1.2 实验方法 精密称取Soluplus、PVPVA64、TPGS三种辅料各360mg，置于900ml 0.2%SDS中。精密称取UA原料药34mg，用4ml甲醇超声溶解，制得UA原料药溶液。将UA原料药溶液加入溶出介质中，在水中形成超饱和溶液，于5、10、15、30、45、60、90、120min分别取样5ml，迅速补充同温空白介质5ml。样品过0.45μm微孔滤膜后，用HPLC检测，绘制不同载体对UA超饱和溶液析晶抑制效果曲线图。结果显示，三种载体对UA超饱和溶液的析晶均有一定抑制作用，但Soluplus的抑晶效果最为突出，故选用Soluplus制备UA-SD。见图1。

图1 不同载体对UA超饱和溶液析晶的抑制作用

3.2 UA-SD的制备

3.2.1 UA-SD制备方法 采用溶剂法制备UA-SD，按照1：3、1：5、1：7、1：9、1：11、1：15的比例，精密称取UA原料药与Soluplus，将UA原料药与载体分别溶于适量无水乙醇中，超声至完全溶解，将载体的乙醇溶液加入原料药的乙醇溶液中，超声10min，于50℃减压回收乙醇，得到白色固体后，置于干燥器内24h，取出，研细，即得到不同比例的UASD。

3.2.2 UA物理混合物的制备方法 精密称取适量UA原料药与Soluplus，采用搅拌的方法将2者混匀，制备载药比1：3、1：5、1：7、1：9、1：11、1：15的UA物理混合物。

3.3 溶出实验

参照《中国药典》四部，桨法，100r/min，37℃，溶出介质为0.2%SDS水溶液，900ml。样品分别为：UA原料药25mg、不同载药比的UA-SD、不同比例的物理混合物（含UA25mg）。于5、10、15、30、45、60、120min分别取样5ml，同时补充同温溶出介质5ml，0.45μm微孔滤膜后，注入HPLC检测，绘制溶出曲线。结果显示，120min时，UA原料药的累积溶出度为10.1%，UA-SD1：3时累积溶出度为36.5%、UA-SD1：5时累积溶出度为39.7%、UA-SD1：7时累积溶出度为48.6%、UA-SD1：9时累积溶出度为59.0%、UA-SD1：11时累积溶出度为102.7%、UA-SD1：15时累积溶出度为87%、PM1：3时累积溶出度为6.67%、PM1：5时累积溶出度为6.73%、PM1：7时累积溶出度为5.60%、PM1：9时累积溶出度为5.75%、PM1：11时累积溶出度为4.74%、PM1：15时累积溶出度为6.32%。与原料药相比，物理混合物在120 min时累积溶出度无明显增加，而UA-SD在120min累积溶出度明显增高，其中1：11和1：15的SD增加最为明显，故选择两个比例的样品进行表征。见图2。

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图2 不同样品的溶出曲线

3.4 溶解度实验

3.4.1 介质的配制 按照《中国药典》2015版溶液配制方法分别配制pH1.2、4.5、6.8、7.2的缓冲溶液，以及加入0.2%

SDS的 pH1.2、4.5、6.8、7.2缓冲溶液以及0.2% SDS水溶液。共10种介质。

3.4.2 溶解度实验 在6.1配制的10种介质中分别加入过量UA原料药、不同载药比UA-SD、物理混合物。将样品放入37℃恒温振荡箱中振荡48h，经13000r/min离心20min后，过0.45μm滤膜，注入HPLC进行检测。结果显示，介质中加入0.2%SDS可有效增加样品的溶解度，同时UA-SD在不同介质中的溶解度大于物理混合物的溶解度，并且随着载药比的不同，溶解度增加程度不同。见表2、图3。

表2 UA原料药在水及0.2%SDS水中的溶解度（μg/ml）

图3 不同载药比例UA-SD、物理混合物在不同介质中的溶解度

3.5 理化性质表征

3.5.1 扫描电镜法（scanning electron microscope, SEM） 取适量样品，用扫描电镜对样品进行分析。测试条件：电流10 mA，加速电压5.0 kV。将SEM图放大100倍时观察图像，见图4。

图4 SEM图谱

由图4A可知，UA原料药为不规则棱柱形晶体，由图4B可知，载体Soluplus近似球状，由图4C、4E可知，1：11、1：15的UA-SD为不规则的团块状，由图4D、4F可知，1：11、1：15的UA物理混合物为Soluplus球状载体上粘附有UA原料药。

3.5.2 差示扫描量热法（differential scanning calorimetry,DSC） 选用DSC250热分析仪进行分析。测试条件：扫描范围为25 ℃～300 ℃，升温速度为10 K/min，见图5。

图5 DSC图谱

由图5可知，UA原料药的晶体特征吸热峰出现在285℃左右，载体Soluplus的吸热峰不明显，在75℃左右，为一宽、钝的吸热峰。而UA物理混合物中并未出现UA的吸热峰，仅存在载体的特征吸热峰，可能是载体融化时导致药物溶解在载体中，进而未出现UA的特征吸热峰。UA-SD中也仅有较弱的载体特征吸热峰，未出现UA的特征吸热峰。

3.5.3 X射线衍射法（X-Ray Diffraction， XRD） 取适量样品，进行X射线衍射分析。仪器工作电压：40kV，工作电流：40mA，Cu靶。实验条件：2θ扫描范围3~50度，步长0.02度/步，见图6。

图6 XRD图谱

由图6可知，UA原料药5.47°、7.77°、10.87°、12.60°、13.52°、14.46°、16.76°、19.03°、20.35°、21.15°、22.48°、26.76°等处存在较明显的特征衍射峰，而载体Soluplus不存在上述衍射峰；UA物理混合物中，尽管UA的某些特征衍射峰被掩盖，但在7.77°、10.87°、14.46°、16.87°仍可观察到变弱的UA特征衍射峰的存在，表明UA被载体稀释，特征衍射峰减弱，但仍以晶体形式存在；而在UA-SD中UA的特征衍射峰则完全消失，表明UA在SD中可能以无定形形式存在。

3.5.4 傅里叶变换红外光谱法(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR) 取样品适量，与适量的KBr研磨、混合均匀后压片，在400～4000 cm-1波长范围内进行傅里叶红外光谱扫描，记录相应谱图，见图7。

图7 FT-IR图谱

由图7可知，UA原料药中存在2个特征峰，3469cm-1处存在较强的-OH峰，1709cm-1处存在较强的C=O峰。载体Soluplus在1629cm-1处存在一较为明显的特征峰，可区别于UA原料药。UA-SD中，-OH峰由3469cm-1移向低频区3417cm-1，C=O峰由1709cm-1移向高频区1725cm-1，峰强度减弱，同时保留了Soluplus在1629cm-1处的特征峰，UA物理混合物中未出现新峰，可以认为是UA原料药与载体的简单加和。

3.6 工艺验证

根据3.2.1项下的实验方法，制备UA-SD，平行制备3份。根据3.3项下实验方法，对每份UA-SD进行溶出实验，平行3份。经HPLC检测，绘制累积溶出曲线，见图8。

图8 工艺验证UA-SD（1：11）溶出曲线

由图8可知，3批UA-SD1：11累积溶出度在120min时分别达到101%、99%、101%，与3.3项溶出实验结果无较大差异，即可证明此工艺适用于本实验。

4 讨论

UA具有溶解度小、溶出速度慢的特点，故本研究用溶剂法将其制备成固体分散体以提高UA的溶解、溶出度。固体分散体中，载体抑制了被高度分散的粒子聚集趋势（抑晶性），且载体本身可促进药物的溶出。由于UA在无水乙醇中溶解度较好，可以减少实验中溶剂用量，且无水乙醇无毒性，本研究在固体分散体的制备过程中，选用了无水乙醇作为溶剂。实验操作过程中注意事项有：抑晶实验时，注意样品的保温，防止因温度变化导致药物析晶，影响检测结果；溶出度实验时，注意防止药物粘附在溶出杯壁及桨上，否则影响检测结果；溶解度实验时，注意观察不同pH缓冲液中是否出现析晶，以免影响实验结果。

由实验结果可以得出，UA-SD在120min时累积溶出度为102%，远远高于UA原料药及物理混合物的累积溶出度。可能因为UA原料药在SD中以无定形状态存在，分散度增加，故累积溶出度增加。在一定的范围内，固体分散体的累积溶出度随载药比的增大而增加。由此看出，固体分散体成功使原药物的溶解度大大提高，改善了其溶出速率。通过理化性质表征结果显示，FT-IR中峰形的变化提示UA与载体之间形成了氢键。UA原料药以无定形状态分布在载体中，UA原料药的晶体结构发生变化，故累积溶出度得到了提高。

综上所述，以Soluplus为载体制备UA-SD,可明显提高UA的体外溶出度。