江香薷籽挥发油成分和脂肪酸分析及其抗氧化活性研究

罗 琪，邓泽元，洪 滔，郭绍勇，陈雨然，罗黎明，马秋婷，徐 磊，刘志勇*

(1. 江西中医药大学，330004，南昌；2. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，330036，南昌；3. 江西金贝农业科技发展有限公司，338000，江西，新余)

0 引言

江香薷(Mosla chinensis Jiangxiangru)作为江西道地药材，收载于2010版《中国药典》，该药材道地产区主要为新余市渝水区、分宜县等，其为药食两用的草本植物，性辛、微温，有发汗解表、和中利湿之功效[1]。据目前研究，香薷对人体具有重要保健功能和药用功能，极具开发价值[2]，香薷籽油含有多种脂肪酸和大量的不饱和脂肪酸，其中ɑ-亚麻酸含量为50%～60%，ɑ-亚麻酸为构成人体组织细胞的主要成分，对人体的健康有重要的意义，但在人体内不能合成，必须从体外摄取[3]。香薷籽油可作为高营养价值的食用保健油，对抗癌、大脑发育、提高智力和记忆力具有重要作用。但是目前香薷籽类产品较为少见，其并没有得到合理的开发和利用。

近年来，对江香薷枝、叶中挥发油以及香薷籽脂肪酸的成分分析及药用价值研究较多[3-5]，而到目前为止，对江香薷籽挥发油组成及脂肪酸组成分析研究报道较少，还未见江香薷籽脂肪油抗氧化活性的研究报导。因此，本文以江香薷籽为研究对象，采用水蒸气蒸馏法提取江香薷籽中的挥发性成分，通过GC-MS联用技术[6-8]对江香薷籽挥发油化学成分进行分离鉴定；采用有机溶剂浸提法提取江香薷籽脂肪油，利用气相色谱分析江香薷籽脂类组成，并用面积归一化法测定其百分含量；进一步通过测定二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力和总抗氧化能力来综合考察江香薷籽油的抗氧化活性，以期为江香薷这一江西道地药材的质量鉴定、开发利用、药理作用及临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器与设备 Agilent GC/Q-TOF 7250型气相色谱-质谱联用仪(NYSE: A)；色谱柱为DB-Wax(15 m×250 μm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱；普通玻璃水蒸气蒸馏装置；SXKW数显控温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)；电子天平HZQ-A10(福州华志科学仪器有限公司)；CO2细胞培养箱(德国Binde公司)；高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司)；3001多功能全波长酶标仪(Thermo公司)；96 孔细胞培养板(Corning 公司)；illi-Q-Zntegral 10型超纯水机(厦门精艺兴业科技有限公司)；6890N型气相色谱(gas chromatograph，GC)仪(美国Agilent公司)；色谱柱为CP-Sil88(100 m×0.25 mm，Chrompack，Bridgewater，NJ)熔融石英毛细管柱；多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)；0ZF-6050型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.2 材料与试剂 江香薷：于2021年采自江西省新余市分宜县金贝农业科技发展有限公司中药材种植基地。正己烷、三氟化硼BF3(溶剂为体积分数14%甲醇)、甲苯(西陇科学股份有限公司)；无水乙醚(天津大茂化学试剂厂)；人乳腺癌 MCF-7细胞系(武汉富衡生物有限公司)；磷酸缓冲溶液、0.25%胰蛋白酶、DMEM高糖培养基(北京索莱宝公司)；胎牛血清(Serana)；总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS)(碧云天)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝公司)；DPPH试剂(上海源叶生物科技有限公司)；无水乙醇、二甲基亚砜均为分析纯；水为纯化水。

1.2 实验方法

1.2.1 江香薷挥发油的提取 将采收回的带籽江香薷阴干后，揉搓其果穗，收集搓落下的江香薷籽，除净茎叶，备用。准确称取江香薷籽80 g，置于研钵中研碎，置于挥发油提取器中，按照《中国药典》2010版附录提取并收集淡黄色油状液体，用无水硫酸钠干燥，装于离心管中密封低温保存备用。取挥发油用正己烷稀释500倍后，各取等量10 μL于溶剂瓶中用于GC-MS分析。

提取率(%)= 挥发油体积(mL)/江香薷籽重量(g)× 100 %。

1.2.2 GC-MS检测条件 气相色谱条件：色谱柱为DB-Wax(15 m×250 μm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温初始温度60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温至190 ℃，维持6 min，再以5 ℃/min将温度升至250 ℃，维持5 min。氦气为载气，柱流量为1.0 mL/min，进样口温度为250 ℃。分流进样，分流比为40:1，进样量为0.2 μL。

质谱条件：离子源为EI源，电子轰击能量为70 eV，倍增电压为1.765 kV，离子源温度为230 ℃，质量扫描范围m/z：50～550 。

1.2.3 江香薷籽油的提取 江香薷籽经干燥、粉碎后，加入无水乙醚(料液比1:8)，60 ℃下回流提取6 h，抽滤得浸提液，液相静置分层，分离油相，经减压蒸馏回收溶剂，真空干燥即可，得江香薷籽油粗品。

1.2.4 江香薷籽油脂肪酸化学组分测定

1)甲酯化[9]：精密量取2 mg江香薷籽油于试管(10 mL)中，随后于试管中加入2 mL BF3和1 mL甲苯，短暂使用氮气风吹，放入水浴锅水浴(90 ℃)1 h，冷却至室温，于试管中加入3 mL正己烷以及1 mL蒸馏水，涡旋混匀，涡旋后离心(2 000 r/min)10 min。离心分层后用无水Na2SO4柱将上层溶液干燥，再次使用氮气吹至风干，再次加入1.0 mL正己烷，最后透过滤膜(0.45 μm)过滤。

2)GC条件：色谱柱为CP-Sil88(100 m×0.25 mm，Chrompack，Bridgewater，NJ)熔融石英毛细管柱；进样口温度为250 ℃，压力为24.52 psi，总流速为29.4 mL/min。燃气为氢气和空气，氮气为助燃气，流速分别为30 mL/min、300 mL/min和30 mL/min。恒压不分流，取1 μL进样；升温程序：起始温度45 ℃，维持4 min；将温度升至175 ℃(13 ℃/min)并维持27 min；升温至215 ℃(4 ℃/min)并维持35 min。脂肪酸的百分含量用面积归一化的方法确定(用峰值面积的百分比表示)。

1.2.5 总抗氧化能力测定 取对数生长期人乳腺癌 MCF-7细胞消化接种于6孔细胞培养板中，培养24 h后，精密称定江香薷籽油适量，配制成不同浓度溶液(200 mg/mL、250 mg/mL、300 mg/mL、350 mg/mL、400 mg/mL、450 mg/mL)，试验组分别加入江香薷籽油(200 mg/mL、250 mg/mL、300 mg/mL、350 mg/mL、400 mg/mL、450 mg/mL)2 mL于37 ℃和CO2培养箱继续培养24 h后，收集约100万个细胞，分别加入200 μL pbs溶液，于超声粉碎机中破碎细胞，后于4 ℃离心机中离心(12 000 g)5 min，取上清。

1)蛋白测定。按照BCA试剂盒说明书操作。BCA试液与Cu试剂按50：1的比例配制成工作液，取10 μL BSA标准品用PBS稀释至100 μL，使终浓度为0.5 mg/mL。将标准品按0 μL、 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL加入96孔板中，再分别加入PBS(20 μL、18 μL、16 μL、14 μL、12 μL、8 μL、4 μL、0 μL)。将10 μL样品和10 μL pbs加入96孔板的样品孔中。各孔分别加入BCA工作液，37 °C反应15—30 min。通过酶标仪测定A562, 通过标准曲线计算出各样品蛋白浓度。

按照总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS)说明书操作，将过氧化物酶工作液(20 μL)加入每个检测孔(96孔板)，空白对照孔中加入蒸馏水(10 μL)；标准曲线孔内加入10 μL各种浓度的Trolox标准溶液(0.15 mM、0.3 mM、0.6 mM、0.9 mM、1.2 mM和1.5 mM)；各种样品(10 μL)加入样品孔内，轻晃混匀。ABTS工作液(170 μL)加入每个孔内，混匀。室温下反应6 min，于414 nm波长下测定吸光度A414。根据标准曲线方程，计算待测样品的总抗氧化能力值。

1.2.6 DPPH自由基清除能力测定 将DPPH用无水乙醇配制成0.05 mg/mL的溶液，放置4 ℃冰箱并避光保存。用无水乙醇配制成不同质量浓度的江香薷籽油溶液(10 mg/mL、6 mg/mL、 4 mg/mL、2 mg/mL、0.5 mg/mL和0.125 mg/mL)。将不同浓度的样品和0.05 mg/mL的DPPH溶液各100 μL依次加入96孔板中，轻晃混匀，在室温下避光孵育30 min，通过酶标仪测定吸光度A517 OD1，同样测定样品溶液与无水乙醇各100 μL混合液吸光度A517 OD2，再测定DPPH溶液与无水乙醇各100 μL混合液在A517 OD3，清除率按下式计算，并以维生素c为阳性对照，平行测定3次。

清除率%= [ 1- ( OD1-OD2) /OD3]×100%。

2 结果与分析

2.1 江香薷籽挥发油提取率

实验结果发现江香薷籽挥发油提取得率分别为0.63%。

2.2 江香薷籽挥发油GC-MS分析

在上述色谱与质谱条件下进行GC-MS分析，得到江香薷籽挥发油的总离子流色谱图, 如图1所示。

图1 江香薷籽挥发油 GC-MS 总离子流示意图

江香薷籽挥发油的各化学成分及其相对百分含量等如表1所示。

表1 江香薷籽挥发油化学成分GC-MS分析结果

表1 (续)

从表1可知，江香薷籽挥发油成分主要鉴定出31种挥发性成分，其中占比最高的是1，3-二甲基-4-乙基苯(6.49%)，其次为2，3，5，6-四甲基苯酚(6.44%)和(+)-柠檬烯(6.09%)。由表2可知，挥发油成分主要分为萜类(8种)、烯烃类(2种)、酮类(1种)、酚类(4种)、酯类(2种)、烷烃类(6种)、醇类(6种)、芳香类(2种)。其中萜类化合物种类(8种)及相对含量(13.95%)最多，其次酚类(13.54%)和醇类(9.39%)占比最高，醇类(6种)和烷烃类(6种)种类最多。

表2 江香薷籽挥发油种类及相对含量

2.3 江香薷籽油脂肪酸组分分析

江香薷籽脂肪酸的气相色谱图见图2。根据标准图谱的保留时间及峰面积大小，可鉴别出脂肪酸种类及江香薷籽中各脂肪酸百分含量，见表3。

图2 江香薷籽油脂肪酸的GC图谱

表3 江香薷籽油的脂肪酸组成

由表3可知，江香薷籽油经GC分析后共鉴定出7种化学物质，其中大部分属不饱和脂肪酸，含量较高的有18:3n-3(α-亚麻酸)(67.34%)、9C12C18:2(亚油酸)(12.97%)、9C18:1(油酸)(9.18%)、16:0(棕榈酸)(7.22%)等。江香薷籽油中不饱和脂肪酸含量较高，且其中α-亚麻酸高达67%，目前自然界中，人类所发现含有α-亚麻酸最高的食用油是紫苏籽油(67%)。故江香薷籽油具有很高的营养价值，可作为一种新型的功能油脂，具有极高的食用价值。

2.4 江香薷籽油总抗氧化能力

ABTS法测定总抗氧化能力的原理见图3。在一定的氧化剂作用下ABTS可被氧化成ABTS·+，而在抗氧化剂存在时ABTS·+生成减少，测定吸光度A414或A734即可计算出各样品的总抗氧化能力。

由BSA蛋白标准品标准曲线可知，其在0～0.5 mg/mL之间线性关系良好，回归方程为Y=0.841X+0.194 2(r=0.995 7)，根据标准曲线计算出蛋白浓度；由Trolox标准品标准曲线可知，其在0.15～1.5 mM之间线性关系良好，回归方程为Y=1.172 5X+ 0.003 3(r=0.999)，根据标准曲线公式即得出该样品的抗氧化能力为0.5 mmol/g，同时测得维生素c的抗氧化能力为1.024 mmol/g，结果表明江香薷籽油具有一定的抗氧化能力，但与维生素c相比，抗氧化能力存在一定差距。

2.5 江香薷籽油DPPH 自由基的清除能力

由图4可知，在实验范围内，江香薷籽油浓度与江香薷籽油DPPH的清除能力存在正相关关系。随着江香薷籽油浓度的增加，DPPH清除能力随之增强，当江香薷籽油浓度为10 mg/mL时，其DPPH清除率达到58.168%(表4)。也就证实江香薷籽油拥有一定的清除DPPH自由基的能力，但与Vc比较清除力依然较弱。

表4 江香薷籽油DPPH 自由基的清除能力

图4 江香薷籽油DPPH 自由基的清除能力

3 讨论与结论

本试验中，利用GC-MS等方法对江西省新余市分宜县江香薷籽挥发油及脂肪酸进行了化学成分分析及体外抗氧化活性试验，结论如下。

1)江香薷籽挥发油主要的化学成分是1，3-二甲基-4-乙基苯、2，3，5，6-四甲基苯酚和(+)-柠檬烯，且挥发油成分主要分为烯烃类、醇类、酮类、酯类、酚类、萜类、烷烃类和芳香类，其中萜类化合物占比及种类最高，而很多萜类化合物具有重要的生理活性，是研究天然产物以及开发新药的重要来源。

2)不饱和脂肪酸是人体不能合成而又必需的脂肪酸，具有调节血脂、清理血栓、免疫调节、维护视网膜、提高视力、补脑健脑、改善关节炎症状减轻疼痛等多种重要生理功能；α-亚麻酸是人体必须的营养素之一，对人体的健康有重要的意义，具有增强智力、提高记忆力、保护视力、改善睡眠、抑制血栓性疾病、预防心肌梗死和脑梗死、降低血脂、降血压等功能[10-13]。气相色谱分析表明江香薷籽油中不饱和脂肪酸含量高，其中亚麻酸含量高达67.34%。而目前自然界中，人类所发现含有α-亚麻酸最高的食用油是紫苏籽油(67%)，表明江香薷籽油可作为优质食用油，极具有开发价值和市场前景。

3)通过DPPH和ABTS常用两种体外抗氧化试验，研究结果表明，江香薷籽油存在一定的体外抗氧化性能，可尝试作为天然的抗氧化剂使用。

综上所述，江香薷籽具有一定的药用价值和较高的营养价值，可在医疗、保健等领域进行更深入的研究与挖掘，其油脂可作为油脂新资源进行深度开发，望本研究数据对于该植物开发利用提供科学依据，同时对药食两用植物资源的开发、利用和保护起一定指导作用。

致谢：感谢江西中医药大学药学院严志宏老师、向汝群硕士在成分检测分析上提供的帮助！