柱层析技术在重组蛋白纯化中的应用

＊朱少瑜

（厦门宝太生物科技股份有限公司 福建 361022）

进入21世纪以来，重组蛋白的分离纯化技术发展非常迅速。重组蛋白的生产分成上游表达和下游纯化两个部分[1]，下游的分离纯化技术是蛋白质工业化生产的关键。在重组蛋白质的分离纯化过程中，层析技术通常用于分离工序的后部，因为其决定着产品的纯度和收率。而柱层析具有高选择性，在蛋白质分离纯化中已成为中流砥柱[2-3]，因而在生物制药行业中得到广泛的应用。

1.柱层析的原理

层析法是根据不同物质理化性质的不同，因而在固定相和流动相中的吸附能力不同而建立起来的分离技术。其核心是样品中的不同组分在固定相和流动相中的分配系数不同，各组分随着流动相的移动而在两相中进行不断的分配。柱层析就是将固定相装填在层析柱内，被分离的组分由于与固定相的吸附力不同而吸附在固定相上。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附解吸频繁作用的过程，与固定相吸附力较弱的组分，率先被洗脱出柱；与固定相吸附力较强的组分，滞后被洗脱出柱，从而达到分离纯化的目的。

2.柱层析的种类

亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶层析这四种层析种类在重组蛋白的分离纯化工艺中是最常用到的。一般来说，大部分纯化工艺需要多种层析方法联用或者仅用一种层析方法来获取纯度合格的目的蛋白。因此选择合适的层析方法并排序是优化蛋白质纯化工艺的关键。

(1)亲和层析(AC)

AC是通过固定相配基与其特异性配体之间的特异性亲和力的不同而分离的层析方法[4]。蛋白质与配基间的结合是可逆的。当蛋白质通过层析柱时，配基直接与目的蛋白结合，也可以与目的蛋白的标签结合。不被吸附的杂质则通过柱体，再利用高浓度的底物溶液或亲和力更强的底物衍生溶液洗脱目的蛋白，从而达到分离纯化目的蛋白的效果。AC具有高收率、高纯度、速度快的特点，也是目前蛋白质分离中最有效的方法[5-6]。一般在纯化工艺的前中期应用。根据后续蛋白的应用需求，某些工艺可能只用一步亲和层析即可获得纯度合格的目的蛋白质，简化工艺步骤和节省时间成本[7]。

(2)离子交换层析(IEX)

IEX分离蛋白的原理是基于蛋白质组分净电荷的不同，通过蛋白质与带电荷的固定相之间的静电作用力结合能力的不同进行分离。即根据蛋白质带电性质的差异，蛋白质组分在离子交换介质上的亲和力不同，用不同的pH或离子强度的缓冲液进行洗脱，从而使蛋白质分离的柱层析方法[8]。离子交换分为两类，阴离子交换层析和阳离子交换层析。在洗脱方式上，阴离子交换层析主要是改变缓冲液的离子强度浓度，一般采用流穿模式，通常用于分离大部分蛋白质和去除内毒素、宿主蛋白、DNA等；而阳离子交换层析主要是改变缓冲液的pH，通常采用吸附模式，带正电荷的目的蛋白吸附在离子交换介质上，带负电的杂质流穿，主要应用于PI（等电点）＞5的蛋白质[9-11]。

因为蛋白质的净电荷受其溶剂pH的影响。当缓冲液pH＞pI时，蛋白质带负电，而当缓冲液pH＜pI时，蛋白质带正电（图1）。因此，理论上可以通过调节缓冲液的pH，利用蛋白质带电性质变化，所有的蛋白质均可用离子交换进行分离。这也是离子交换层析应用范围广的原因。IEX通常用于蛋白质纯化工艺的中期。但是对某些特定的蛋白质而言，在纯化工艺的前期或后期采用该方法也可能很好的将目的蛋白质分离纯化。

图1 缓冲液pH值对蛋白质带电荷的影响

(3)疏水作用层析(HIC)

HIC是依据蛋白质自身的疏水性不同，利用蛋白质与疏水层析介质的相互作用来分离蛋白质。在HIC中，蛋白质在高离子强度的缓冲液中可能导致蛋白质的部分去折叠，将隐藏于内部的疏水基团暴露出来，使蛋白质的疏水性增强，与层析介质的结合力也增强。进行样品洗脱时，降低洗脱液的盐浓度，与层析介质结合的蛋白质会恢复到原来的折叠结构，降低其疏水性，从而把样品洗脱出来，达到分离纯化的目的。

HIC在实验室和工业化生产中得到了广泛的应用[12]。是用于IEX后或者是样品硫铵沉淀后理想的纯化步骤。在这两种情况下，样品缓冲液中都含有高浓度的盐，可以不经过处理或很少的处理步骤即可直接对疏水层析柱进行上样操作。该层析方法通常在蛋白质纯化工艺的中期使用。

(4)凝胶层析(GF)

GF是根据蛋白质的分子大小和形状为分离基础的。即不同的蛋白质分子的大小和形状通过凝胶介质时，不同形状、大小的蛋白质分子经过固定相的路径不同，其所滞留时间的不同来进行分离的一种柱层析方法（图2）。与上述其他层析方法不同的是，蛋白质分子不与凝胶介质相互作用，可以不用更换缓冲液就能对蛋白质进行分离。特别对高分子物质有很好的分离效果。

图2 不同大小的蛋白质混合物用凝胶层析分离

因为GF的分离是根据蛋白质不同组分在层析柱内流经途径的远近之差所达到分离效果，因此对层析柱的长度要求较高，一般为70～100cm。通常可以预估GF的洗脱时间，所以可以根据上样量和间隔时间进行连续上样，从而提高层析柱的使用率，缩短纯化周期。凝胶层析一般用于脱盐、组分分离、测定高分子物质的分子量等。因此，GF通常用在蛋白质纯化工艺的最后一步。

(5)层析方法对比

蛋白质分离纯化的方法很多,对于不同的目标产物，分离纯化的方法不同，而有些相同的目标产物，分离纯化的方法也不尽相同。对于柱层析来说，采用不同的柱层析种类，可能就会得到不同的目标产物，收率、纯度都会影响。因此充分了解柱层析种类的特性，才能设计出蛋白质分离纯化的最佳工艺。表1为应用于蛋白质分离纯化的层析种类对比。

表1 应用于蛋白质分离纯化的层析种类对比

通过对以上几种柱层析种类的特性对比，在蛋白纯化工艺设计时，一般将IEX或HIC放在工艺前端，GF放在工艺后端，AC放在工艺的中间或者不选用，当然也有不同的选择方式。柱层析的选择也可以从盐浓度的连续性或缓冲体系的种类，以及上样量、浓缩体积等方面考虑，尤其是中间采用了离心或超滤等技术时，这就需要进行有机组合。

3.柱层析在重组蛋白纯化中应用

通常在进行重组蛋白质纯化工艺设计之前，首先需要先对目的蛋白的性质、纯化体系和杂质性质进行了解。例如：对目的蛋白的分子量、pI值、疏水性、带电性等特性进行了解。还需对影响目的蛋白活性的因素进行了解，如pH值、有机溶剂、盐浓度、温度、剪切力等，以保证纯化后的蛋白活性。通过对这些性质的了解，方可对纯化工艺进行设计。蛋白质纯化工艺设计的基本原则为：在达到目标活性和纯度的前提下，尽可能采取最少的工艺步骤，来获得最大的回收率。但实际蛋白纯化过程中，通常采用三步纯化策略[13]（图3），这三步分别是：

图3 三步纯化策略示意图

（1）捕获，通常是对目的蛋白进行初步的纯化，将与目的蛋白质性质差异很大的物质去除掉，如细胞中的核酸等；另外，尤其重要的是将那些对目的蛋白质不稳定的物质去除掉，如各种蛋白酶，以达到富集浓缩、稳定产物的目的。通常应用的层析技术有离子HIC、IEX、AC等。

（2）中纯，将那些分子大小、理化性质与目的蛋白质类似的杂质去除掉，一般采用与捕获时不同的层析技术，如HIC。

（3）精纯，最终去除那些微量杂质，达到产品的纯度要求，通常使用GF层析技术，一般选择高选择性的层析介质。

以毕赤酵母表达重组人白细胞介素11（rhIL-11）的纯化生产工艺为例[14]，说明柱层析在重组蛋白生产工艺中的应用。IL-11的纯化工艺路线为：发酵上清→超滤→SP阳离子交换层析→HP疏水作用层析→凝胶过滤。在整个纯化工艺中，发酵上清经超滤浓缩置换缓冲液后的样品电导较低，正好能满足离子交换的上样要求；而经离子交换层析洗脱的样品，样品中含有一定的盐浓度，刚好能满足疏水层析的上样要求，可以直接进行疏水层析上样。而且这两步都是吸附性层析，有较好的浓缩样品的能力，经过这两步纯化后的小体积样品刚好适合于凝胶过滤层析。因此，整个纯化组合相对比较合理，不需要额外的处理步骤，易于工业放大。纯化工艺的总回收率在28%左右，产品的最终纯度在98%以上。

此外，对于纯化同种目的蛋白，采用不同的柱层析工艺也可达到相同的纯化效果。同样以特宝rhIL-11（特尔康）的纯化生产工艺为例[15]：发酵上清→超滤→CS金属螯合层析→酶切→SP阳离子交换层析→凝胶过滤。整个纯化工艺的捕获阶段，通过金属螯合层析的高选择性、高分辨率、高载量，在纯化初期就将大部分的杂质去除与样品浓缩，减少样品体积。样品经过酶切，通过阳离子交换将其余杂质去除，产品最终纯度达到99%以上，总回收率在30%左右。

通过对以上两种不同的纯化工艺的对比，经过对目的蛋白（IL-11）的检验分析[14]，其结构和性质是相同的。因此在进行蛋白纯化工艺的设计时，可根据自己现有的设备、材料以及实际需求来选择合适的柱层析种类，从而降低生产成本，提高生产效率。

4.结语

柱层析技术是目前较为先进和完善的蛋白质分离纯化技术，具有高分辨率、高收率、高纯度、能耗低等优点，是目前蛋白质产品分离纯化的重要手段。为蛋白质产品的产业化、工业化提供了重要保证。