菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

蒋莉萍，周春苗，钟浩天，张景景，刘义飞，刘 迪

（湖北中医药大学药学院 武汉 430065）

菊花脑（Chrysanthemum nankingenseHand.-Mazz.）是菊科菊属野菊（C.indicumL.）的近缘植物，主要分布在江苏及其邻省，例如湖南省、贵州省等，在湖北一些地方已成功进行了引种栽培，生态适应性较强。药理研究表明，菊花脑具有清热降火、解毒和降血压等功效[9-10]，并且对具有抑菌作用，广泛作为药食两用的原料，在高端市场深受欢迎，具有一定的经济价值。菊花脑挥发油中含有丰富的萜类成分，主要成分为单萜、倍半萜及其含氧衍生物，芳樟醇是菊花脑的关键特征香气物质之一[11-12]。研究表明，芳樟醇是一种天然的抗炎剂，在杀菌抗炎等方面起重要作用[13-14]。

目前，萜类合成途径已基本被阐明，主要由三个阶段组成：①前体物质的生成；②直接前体的形成；③萜类化合物的生成和后修饰[15-17]。在植物体中主要有位于质体的甲基赤藓醇磷酸盐途径（Methylerythritol phosphate pathway，MEP）和位于细胞质的甲羟戊酸（Mevalonate pathway，MVA）途径[15,18]。萜类合酶是催化直接前体香叶基焦磷酸（Geranyl pyrophoaphate,GPP）形成芳樟醇、香叶醇和月桂烯等单萜类物质的关键限速酶[19]。之前研究表明，萜类合酶具有复杂多样性，其主要表现在：①同一萜类合酶可催化不同的直接前体，如猕猴桃的AcNES1 可催化两种直接前体GPP 和FPP（法尼基焦磷酸，Farnesyl diphosphate），分别产生芳樟醇和橙花叔醇[20]；②不同的萜类合酶可催化同一直接前体产生不同的化合物，如杜鹃的RoTPS059和RoTPS065可催化GPP生成多种单萜类物质（芳樟醇、L-α-松油醇、3-蒈烯和β-月桂烯等）[21]；③在同一物种中，不同酶可催化同一底物形成相同产物，如金鱼草花中AmNES/LIS-1 和AmNES/LIS-2 等2个萜烯合酶均可催化GPP 产生芳樟醇，催化FPP 形成橙花醇[22]。本文在菊花脑基因组和转录组的数据基础上[23]，首次从菊花脑中克隆和鉴定出一个芳樟醇合酶基因，对其进行生物信息学分析，展示其在不同组织表达的特异性，并在大肠杆菌中进行原核表达，以期为解析菊花脑中萜烯类物质的生物合成机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验样品采自湖北中医药大学野菊种质资源保存圃，经植物标本比对鉴定为菊花脑。2020 年6 月选取10个单株进行扦插繁殖，11月末待其盛花期取舌状花、管状花、根、茎和叶五个不同的组织进行后续分析，生物学重复为每个部位3 个单株重复。所有样品采集时间集中在上午9 点至11 点完成，样品经液氮速冻后，-80℃冰箱保存备用。

1.2 试剂

TransStart® FastPfuDNA Polymeras 试 剂 盒 、pEASY®-Blunt 克隆载体和Trans1-T1 大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司。OMEGA 琼脂糖凝胶回收PCR 产物纯化试剂盒、SDS-PAGE 试剂盒购于北京诺博莱科技有限公司。EcoR I 内切酶、Hind Ⅲ内切酶、ABclone MultiF Seamless Assembly Mix购于爱博泰克生物有限公司，IPTG 粉末、卡那霉素、LB 粉末购自索莱宝生物科技有限公司。植物总RNA提取试剂盒购于百泰克（北京）有限公司。PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)和 PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（RR047A）购于宝生物工程（大连）有限公司。大肠杆菌BL21 和DH5α 感受态细胞购于上海唯地生物技术有限公司。

1.3 总RNA提取及cDNA合成

按照百泰克多糖多酚植物总RNA 快速提取试剂盒（RP3202）操作说明提取菊花脑根、茎、叶、舌状花、管状花中总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。超微量分光光度计（Nano drop-2000）测定菊花脑总RNA A260nm/A280nm 等参数指标，采用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA，6210A)和PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TAKARA，RR047A）进行反转录合成两种cDNA 分别用于目的片段的克隆和实时定量PCR，置于-20℃长期保存。

1.4 CnTPS1基因cDNA的克隆

根据菊花脑基因组数据筛选到CnTPS1基因的CDS 序列，运用Snapgene 软件设计包含完整开放阅读框 的 正 反 引 物 。 上 游 引 物CnTPS1-F：5’-ATGGCATCAATAAGCTTATTTCCA-3’；下 游 引 物 ：CnTPS1-R：5’-TTATATCCCTTGGATAGGAGTGAAC-3’。 以 菊 花 脑 的 cDNA 为 模 板 ，采 用 全 式 金TransStart®FastPfuDNA Polymeras 试剂盒进行 PCR 扩增（AP221），PCR 反应体系 50μL：cDNA 1μL，引物CnTPS1-F 1μL，引物CnTPS1-R 1μL，5 ×TransStart®FastPfuBuffer 10μL，dNTPs 4μL，TransStart® FastPfuDNA Polymeras 1μL，ddH2O 32μL。PCR 反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸 1 min，40 个循环；72℃ 5 min 结束反应，保存于12℃。

1.5 PCR产物纯化及克隆测序

PCR 扩增产物由1%琼脂糖凝胶电泳富集至同一位置，确定目的片段大小，沿着目的片段的荧光切胶，目的片段胶用琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根DP209）溶解 、纯 化 ，用pEASY®-Blunt Cloning Kit（Transgen,CB101）试剂盒与Blunt 载体连接，并转化到大肠感觉DH5α 感受态细胞，涂布在含有卡那霉素的LB 固体培养皿的平板，12h后挑取单克隆进行PCR 验证，阳性克隆菌液送至生工生物工程有限公司（武汉）完成测序。

1.6 生物信息学分析

利 用 ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线软件查找CnTPS1基因完整的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）；利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线工具 BLASTP 对CnTPS1基因氨基酸序列进行相似性比对，BLASTX 对CnTPS1基因碱基序列进行同源比对；利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）在线工具预测CnTPS1氨基酸序列的理化特性；利用 SPOMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）对CnTPS1 氨基酸序列二级结构进行分析；利用Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/）对CnTPS1 氨基酸序列进行蛋白质三级空间结构预测分析。利用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析CnTPS1 氨基酸序列保守结构域；利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测 CnTPS1氨基酸序列的跨膜结构域；借助PSORT II Prediction（https://psort.hgc.jp/form2.html）进行亚细胞定位预测。不同植物TPS基因氨基酸序列比对采用ClustalW 软件，MEGAX 软件同于邻接（neighbor-joining）系统进化树构建，重复比对次数（bootstrap）为1000次。

实施党员“三评议”写实考核加强房地产企业党员的教育管理………………………………………………………………于 峰（10.48）

1.7 实时荧光定量PCR

选用 TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus，TaKaRa）试剂盒，利用 Roche Light Cycler 480 荧光定量PCR 仪对菊花脑5 个组织中CnTPS1转录的mRNA 丰度进行定量检测。不同组织CnTPS1转录的mRNA 拷贝数据使用菊花脑内参基因Actin进行校正，上游引物Actin-F：5'-AGCCGTTCTTTCCCTGTATG-3'，下游引物Actin-R：5'-GAATACCCACGCTCTGTAAGG-3'[24]。应用Snapgene 软件设计菊花脑CnTPS1基因荧光定量短片段（250 bp）正反引物，上游引物qCnTPS1-F：5'-GCTGAGTTTCATGTAAGGCG-3'，下 游 引 物qCnTPS1-R：5'- GATTTTCGTATCATTGTCTTCACTG-3'。采用 20μL 的反应体系，其中 cDNA 模板 2μL、上下游引物各0.8μL，2 × TB GreenPremix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10μL，RNasefree H2O 6.4μL。反应程序：预变性95℃、30 s；定量分析95℃、5 s，60℃、30 s，共40 个循环；溶解曲线95℃、5 s，60℃、1 min，95℃（模式Continuous）；降温60℃、30 s。每个组织三个生物学重复及三次机械重复。根据溶解曲线的峰图特征判断产物是否特异；依据定量扩增曲线的 Ct 值，用 2-ΔΔCt公式计算CnTPS1基因在不同组织的基因表达量。

1.8 CnTPS1原核表达载体构建与诱导表达

对CnTPS1核苷酸序列酶切位点进行分析，设计带有酶切位点的同源臂正反引物。根据原核表达载体pET-28a上的EcoRI和HindⅢ酶切位点，利用PrimerPremier5软件设计同源重组引物，上游同源臂引物EcoRI-CnTPS1-F：5’-GCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGCATCAATAAG CTTATTTCCA-3’；下游同源臂引物HindⅢ-CnTPS1-R：5’AAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTATATCCCTTG GATAGGAGTGAAC-3’。使用高保真Mix 扩增两端含有同源臂的全长序列，PCR 产物溶解回收，同时EcoRI和HindⅢ双酶切pET-28a 原核空载体。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，切胶，回收目的条带，并用ABclone MultiF Seamless Assembly Mix 连接目的条带和线性载体，构建重组载体质粒。

将测序正确的重组质粒转化至原核诱导感受态细胞BL21（DE3），涂布在含有卡那霉素的LB 培养基平板上，37℃过夜培养至长出单菌落，挑取单克隆进行PCR验证，阳性克隆于含有卡那霉素的LB液体培养基37℃培养至OD 值为0.5-0.6（取1 mL 菌液8000 rpm 离心5 min，收集菌体，弃上清，向沉淀中加入250μL Tris-HCl 裂解液，保存于4℃，用于后续跑胶），加入IPTG 至终浓度为0.1mM，16℃诱导培养20h，以同样条件处理pET-28a 空载作为空白对照。取4 m L 菌液，8000 rpm离心5 min，收集菌体，弃上清，向沉淀中加入1mLTris-HCl 裂解液，用超声细胞破碎仪（宁波新芝，JY96-IIN）超声10 min，破碎菌体，取500μL 破碎菌体保存于4℃，用于后续跑胶；在4℃的条件下，剩余500μL 破碎菌体于 8000 rpm 离心 5 min，吸取上清，向沉淀加入 500μL Tris-HCl 裂解液，重悬。分别取 40μL 空载、未诱导、诱导后粗酶、上清和沉淀，加入10μL 上样缓冲液，混匀，煮沸10 min，上样后进行12%SDSPAGE电泳分析。

2 结果与分析

2.1 CnTPS1的克隆

根据菊花脑基因组信息，以菊花脑叶片提取的总RNA 经反转录获得的cDNA 为模板，PCR 扩增并进行琼脂糖凝胶电泳显示得到了清晰的特异条带，条带长度大小与预期相符合（图1），并将其重组载入Blunt 载体中，测序结果用CodonCode Aligner 软件拼接测序结果的峰图，得到1749 bp 的cDNA 序列，命名为CnTPS1（NCBI 登录号为 OM621911），经 ORF Finder 在线软件分析发现其为一个完整的开放阅读框，共编码582 个氨基酸。

将菊花脑CnTPS1编码的氨基酸序列提交到NCBI网站应用BLASTP 进行序列比对，比对结果显示CnTPS1 氨基酸序列与UniProtKB/Swiss-Prot 数据库中已功能验证的植物TPS 氨基酸序列有较高的同源性，其中CnTPS1与青蒿（Artemisia annua）两个芳樟醇基因编码的氨基酸序列相似度最高（与Q9SPN1.1相似度为91%，与Q9SPN0.1 相似度为89.88%）；利用MEGAX 比对CnTPS1 与序列相似性前五的其他植物TPS基因的氨基酸序列，发现均含有萜类合酶保守结构域DDxxD、R(R)X8W和NSE/DTE（图2）。

图2 CnTPS1与其它植物萜烯合酶的多序列比对

2.2 生物信息学分析

利用在线软件ExPASy 对CnTPS1基因编码的氨基酸序列进行基本理化特性分析。结果表明，CnTPS1编码582个氨基酸；等电点pI值为5.72（＜7），属于酸性蛋白；疏水性为-0.247（＜0），属于亲水性蛋白；不稳定指数为35.54（＜40），属于稳定蛋白；编码的蛋白由20种氨基酸组成，其中亮氨酸（Leu）和丝氨酸（Ser）所占比例最多，分别占11.8%和8.1%。

NCBI 的Conserved domains 在线工具分析表明，CnTPS1编码的蛋白质具有Terpene_cyclase_plant_C1活性位点，属于Isoprenoid_Biosyn_C1 超家族（图3A）。利用TMHMM2.0 在线工具预测CnTPS1 是否具有跨膜结构域（图3C），结果显示，CnTPS1 氨基酸中无跨膜结构存在，为膜外蛋白。通过在线程序PSORT II Prediction 对CnTPS1 蛋白进行亚细胞定位预测，结果显示CnTPS1 在细胞质、线粒体和质体中定位的概率分别为60.9%、17.4%和21.8%，因此，该蛋白可能是位于细胞质中。

图3 CnTPS1的生物信息学分析

利用在线生物学工具SOPMA 预测菊花脑CnTPS1氨基酸序列的二级结构（图3B）。结果显示，该蛋白的二级结构主要由α-螺旋结构（alpha helix）和无规则卷曲（random coil）组成，占 93.49%，其次是延伸链（extended strand）和 β-转角（beta turn），分别占比3.60% 和2.92%（表1）。利用在线服务器SWISSMODEL对菊花脑CnTPS1蛋白进行三维空间结构同源建模，匹配最佳三维空间模型（图3D），其蛋白的折叠情况与二维结构相似。经在线软件ExPAsy structure assessment 推导，CnTPS1 蛋白最佳模型为 3n0f.1.A，得分为0.73，蛋白序列的相似性为43.58%。

表1 CnTPS1蛋白二级结构预测

为分析CnTPS1 与其他物种萜烯合酶间的亲缘关系，通过MEGAX 等软件对CnTPS1 进行系统发育进化树分析。结果表明（图4），CnTPS1 与青蒿、薄荷、薰衣草及番茄等物种中的芳樟醇合酶基因聚为同一簇，其中与青蒿的亲缘关系最近，与其他倍半萜和二萜合酶基因的遗传距离较远，推测其可能为一个芳樟醇合酶。

图4 CnTPS1与其他物种萜烯合酶系统发育进化树分析

2.3 组织表达特性分析

利用qRT-PCR技术分析CnTPS1在菊花脑盛花期各组织中的相对表达量。结果表明CnTPS1基因在菊花脑各个组织部位均有表达，在茎和管状花中的表达量显著高于根、舌状花和叶（图5）。CnTPS1基因的相对表达量为：茎＞管状花＞根＞舌状花＞叶，与转录组基因表达量大体趋势一致。由此可以看出CnTPS1基因在不同组织中表达量存在显著差异，揭示其所催化的萜类物质的生成和积累可能同样具有组织特异性。

图5 不同组织中CnTPS1基因表达水平

2.4 CnTPS1原核表达载体构建及诱导表达分析

将构建好的原核表达重组载体质粒pET-28a-CnTPS1经液氮转化法转至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞内，挑取若干单菌落，进行菌液PCR 验证，鉴定结果为阳性，表明目的基因CnTPS1成功插入到表达载体中，并转化至表达感受态细胞。重组载体质粒菌株表达产物进行12% SDS-PAGE 蛋白电泳验证。电泳胶图显示（图6），含有CnTPS1 重组蛋白的全菌及沉淀在67.58 kDa 处出现明显的特异蛋白条带，符合预期。CnTPS1蛋白在沉淀中表达量较高，但在上清中表达量较小，说明蛋白表达形式倾向于包涵体，不适合进一步纯化分析，适合用总蛋白和底物反应，测定酶活。

图6 CnTPS1重组蛋白的SDS-PAGE电泳图

3 讨论

菊花脑属于菊科菊属野菊近缘植物，野菊倍性复杂（例如二倍体、四倍体、六倍体野菊等），故菊花脑可以作为模式植物开展野菊的相关研究。菊科植物具有特殊的香气，这些香气成分以萜烯为主[25-28]。萜烯是植物体内中种类最多、分布最为广泛的次生代谢产物,是植物与植物间、植物与昆虫间的信号素[29-31]。萜类合酶的种类和数量是萜烯丰富多样的原因，因而挖掘和分析萜类合酶基因对研究植物萜烯类代谢产物的多样化具有重要意义。

萜类合酶可以分为TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g、TPS-h 等七个亚家族，其中 TPS-a 主要是倍半萜合酶基因，TPS-b 主要是单萜合酶基因[32]。单萜合酶主要定位于质体，倍半萜合酶主要定位于细胞质[33]。本研究克隆了一个菊花脑TPS 基因CnTPS1，得到了编码582 个氨基酸全长1749bp 的cDNA 序列。通过NCBI BlastP，发现鉴定的CnTPS1基因与青蒿的两个芳樟醇合酶基因具有高度的同源性，序列相似性均大于90%，推测该基因为芳樟醇合酶。与序列相似度较高的其它物种的萜类合酶序列比对，发现该基因具有萜类合酶的保守结构域：DDxxD、R(R)X8W 和NSE/DTE。

萜类化合物的结构复杂性和多样性主要来自萜烯合酶（TPS）催化前体（C5异戊二烯）的环化模式。根据线性前体底物的环化的启动方式，TPS 可以分为两类（I 和II）。 I 类TPS 是金属依赖性酶，其通过对碳结构发电的二磷酸酯来引发线性异戊二烯二磷酸的环化，而II类TPS在异戊二烯底物的C=C键或环氧化物的质子化引发催化[34]。在结构上，富含天冬氨酸的DDxxD 基序和 NSE/DTE 基序通常存在于 I 类 TPS 中，而一般酸基序DxDD 是II 类TPS 的标志[35]。菊花脑CnTPS1基因属于 I 类 TPS，理论上可以催化 GPP 和FPP 形成萜类化合物。亚细胞定位预测分析显示CnTPS1基因定位在细胞质中的可能性最大，这与番茄、薰衣草、茶树和青蒿等芳樟醇合酶在细胞中的定位结果一致[36-39]。

CnTPS1基因在舌状花、管状花、叶、茎和根中都有表达，但是存在组织特异性，以茎和管状花中表达最多。这可能与芳樟醇防御病虫害以及在管状花中挥发油的成分有关。该基因在原核表达体系，经过IPTG 16h 的诱导能够在总蛋白中诱导得到目标大小的蛋白，符合前期对CnTPS1基因生物信息学的相关分析。预测该基因可以与GPP 或FPP 底物结合产生以芳樟醇为主产物，其它单萜和/或倍半萜为次产物的混合产物。青蒿（Artemisia annuaL.）三个TPS-b 分支基因AaLS(QH1和QH5)和AaBPS之前被证明编码单萜合成酶，分别催化GPP 形成(3R)-芳樟醇和β-蒎烯[38,40]。合欢（Albizia julibrissin）的AjTPS10基因被验证是芳樟醇合酶，只能形成单产物芳樟醇[41]。到手香（Plectranthus amboinicus）中克隆到一个萜类合酶PamTps1，体内外功能研究均表明其形成芳樟醇[42]。Yu 等基于铁皮石斛（Dendrobium officinale）全基因组鉴定TPS 基因家族及表达谱，并克隆和分析了DoTPS10基因的功能，该基因定位在叶绿体中，重组DoTPS10蛋白在体外能特异将香叶酰二磷酸转化为芳樟醇[43]。本研究基于菊花脑全基因组数据，克隆到一个TPS基因，通过生物信息学分析，预测该基因编码的蛋白的生理生化特性以及二级、三级结构等，并检测该基因在各组织特异的表达模式，利用原核系统成功诱导出67.58 kDa大小的蛋白；通过与其它已验证功能的萜类合酶基因进行比较推测，预测该基因可能催化单萜或倍半萜合酶的底物(GPP/FPP)产生萜烯类化合物。后期本研究将从全基因组水平，联合转录组、代谢组和功能基因组学等多组学手段，系统地挖掘菊花脑萜类合酶（TPS）基因家族，为深入解析菊花脑萜类物质的生物合成途径与代谢调控的分子机制提供理论依据。