基于网络药理学和分子对接的柴胡疏肝散及成分治疗肝癌的分子靶点和疗效预测＊

张泽鑫，陈祎琦，吴汶丰，黄子怡，林思其，方舒涵，林丽珠，钟 崇，李 菁

（1. 广州中医药大学第一临床医学院 广州 510405；2. 广州中医药大学第二临床医学院 广州 510405；3. 广州中医药大学第一附属医院 广州 510405；4. 湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410000）

肝癌是目前威胁人类生命健康的恶性疾病之一。根据病理类型可分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 、肝 内 胆 管 癌 （intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）以及混合型癌[1-2]。其中肝细胞癌约占原发性肝癌的80%[3]（以下简称肝癌）。《2020全球癌症报告》显示，肝癌在我国发病数达41万，约占全国癌症发病数的9%。死亡人数约为39.1 万，为癌症死亡原因的第二位[4]。由于恶性程度高、早期诊断困难、进展隐匿、高复发率等因素，肝癌患者总体预后不理想[5-6]。因此，寻找更佳的治疗手段及建立预后评价模型具有重要临床价值。

肝癌归属于中医的“癥瘕”“肥气”“积聚”等范畴[7-9]，中医认为肝性喜调达恶抑郁。肝失疏泄，脏腑失调，气滞血瘀，湿热等病理产物蕴结，渐而成积[10,11]。柴胡疏肝散是疏肝解郁的代表方，其药物组成包括柴胡、芍药、香附、川芎、陈皮、枳壳、甘草，诸药共奏疏肝解郁，活血止痛之功[12-13]。有研究发现，柴胡疏肝散联合分子靶向药可以有效避免肝癌肿瘤的进展和对肝脏的损伤[14]。在肝纤维化方面，尚立芝等进行大鼠模型实验，发现柴胡疏肝散具有抗肝纤维化的作用[15-16]。然而，目前对于柴胡疏肝散治疗肝癌的分子靶点和机制仍然需要进一步研究。

生物信息学分析用于研究肿瘤的基因表达及作用通路，有助于揭示疾病发生机制及筛选潜在生物标志物[17-18]。加权基因共表达网络分析，能通过构建基因网络以实现基因网络的可视化，挖掘高度相关的基因模块[19-20]。结合差异基因表达分析，可以揭示特定疾病的潜在生物标志物[21]。而一致性聚类分析可以将基因根据组学特点分为不同亚型，评估不同亚型的分析结果[22]。因此，通过结合加权共表达分析、差异表达分析和一致性聚类分析结果，能够多维度识别与疾病发生发展高度相关的基因。

此外，网络药理学能够揭示与疾病密切相关的分子靶点[23]，而在此基础上的分子对接方法基于计算机技术分析分子间相互作用，预测其结合模式及亲和力，在分子层面推动疾病基因与药物靶点的研究[24-25]。

因此，本研究结合了网络药理学、分子对接和生物信息学，筛选柴胡疏肝散治疗肝癌的核心靶点并研究其相关机制，构建预后评估模型和列线图，用以评估患者的总体生存情况。

1 材料与方法

1.1 核心靶点的筛选、验证

1.1.1 TCGA肝癌差异表达基因的鉴定

从 TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载了TCGA-LIHC 的表达数据和临床数据。进一步地根据log|FC|＞1，校正P值＜0.05的标准，对正常肝组织和肿瘤组织进行差异表达分析，以筛选出肝癌发生发展密切相关差异表达基因。

1.1.2 TCGA肝癌加权共表达分析

通过R 语言4.0.1 的WGCNA 包，将基因表达和疾病特征进行了联合分析，将疾病特征定义为正常组和肿瘤组。在本研究中，根据软阈值β= 3，我们建立了无标度网络。通过公式AIJ=|SIJ|β（AIJ：基因I 与基因J之间的邻接矩阵，SIJ：通过所有基因对的皮尔逊相关性获得的相似性矩阵，β：软阈值），并转换为拓扑重叠矩阵（TOM）及其相关的相似度（1-tom）。为了将相似的表达基因分为不同的共表达模块，构建了1-tom矩阵的层次聚类树。

1.1.3 GEO-GSE14502一致性聚类分析

从 GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载了GSE14502 的芯片数据和GPL571 平台数据，使用perl语言对其进行基因符号注释。一致性聚类分析根据基因之间的不同功能，划分成不同的聚类模块。在本研究中，R 语言 4.0.1 的“ConsensusClusterPlus”包被应用于该分析。根据一致性打分结果，确定了2 个聚类模块，并且将其与正常组织之间进行了差异表达分析。

1.1.4 肝细胞癌发生发展相关基因的鉴定

为了明确参与肝细胞癌发生发展相关基因，使用R 语言4.0.1 的韦恩图包，对差异表达基因、加权共表达基因（显著性水平：P值排名靠前的3 个模块）、一致性聚类分析模块与正常组织的差异表达基因进行取交集，以获得肝细胞癌发生发展相关基因。

1.1.5 柴胡疏肝散化合物和靶点的鉴定

根据口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）＞30%，类药性( Drug Like，DL)＞0.18 的标准，从 TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和 SymMap 数据库（http://www.symmap.org/）下载柴胡疏肝散（柴胡、白芍、川芎、枳壳、陈皮、甘草、香附）的化合物和靶点，使用perl 语言进行化合物和靶点之间的相互映射，以明确其对应关系。

1.1.6 柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点鉴定

为了鉴定参与肝细胞癌治疗的靶点，我们使用R语言4.0.1 的韦恩图包，对1.1.5.中柴胡疏肝散的所有药物靶点和肝细胞癌发生发展相关基因进行取交集，以获得柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点。

1.1.7 柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的GO 和KEGG 功能富集分析

为了进一步了解柴胡疏肝散治疗肝细胞癌涉及的生物学功能和通路，使用在线的metascape 数据库（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进 行GO和KEGG功能富集分析。在本研究中，设定分析的物种为“智人”，显著性水平P值＜0.05。

1.1.8 PPI蛋白互作网络筛选核心靶点

为了了解柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的核心靶点，使用在线的metascape 数据库（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）构建PPI 蛋白互作网络。根据核心靶点的相互作用关系以及功能聚类，PPI 蛋白互作网络将划分为不同的模块进行展示。

1.1.9 疾病-药物-化合物-靶点网络筛选核心靶点

为了明确柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的主要化合物和核心靶点，使用cytoscape3.7.2 软件构建疾病-药物-化合物-靶点网络。在本研究中，筛选出了具有靶点作用数目排名前3 的化合物，被认为是治疗肝细胞癌的主要化合物。筛选出了具有化合物作用数目排名前10的靶点，被认为是核心靶点。

1.1.10 柴胡疏肝散治疗肝癌“病-症-方/药”网络的构建

为了构建肝郁气滞型肝癌“病-证-方/药”网络，我们在SymMap 数据库中导入了柴胡疏肝散治疗肝癌的化合物或靶点，并且保留疾病-药物-化合物-中医症状-现代医学症状均有对应关系的点，然后使用cytoscape3.7.2绘制网络图。

1.1.11 核心靶点的生存分析

为了探讨核心靶点与生存之间是否存在显著相关，使用TCGA-LIHC 的临床数据进行KM 生存分析。在本研究中，根据核心靶点的表达量，我们截取了中位数划分为高低两组，对秩数检验水平＜0.05 被认为具有显著性意义。

1.2 预后模型及列线图的构建

1.2.1 单因素cox 分析和LASSO 回归构建柴胡疏肝散治疗肝细胞癌靶点的预后模型

单因素cox 分析是研究单一变量与生存时间，生存状态之间的关系，提供自变量与结局变量之间的危险比，用以评估自变量是否对结局变量存在保护或危险作用。在本研究中，单因素cox 分析用以筛选出柴胡疏肝散治疗肝细胞癌显著影响生存的靶点。然后进一步的LASSO 回归去除了冗杂因素，用柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点构建预后模型。KM 生存分析将模型的评分分为高低两组，对秩数检验＜0.05 被认为具有显著性意义，并且使用ROC曲线评估了模型1，3，5 年的预测能力，ROC 曲线下面积 AUC＞0.6 被认为具有良好的预测能力。

1.2.2 构建列线图用以评估患者的总体生存情况

为了评估患者的1，3，5年生存率，使用单因素cox分析筛选预后相关因素，单因素和多因素cox 分析具有显著性水平的相关因素被认为是独立的预后危险因素，然后将独立的预后危险因素用以构建列线图评估患者的总体生存情况。

1.2.3 药物敏感性分析和分子对接

为了进一步明确柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的化合物和靶点的可靠性，使用癌症药物敏感性的基因组学数据库（https://www.cancerrxgene.org/）对核心靶点进行药物敏感性分析，寻找与靶点密切相关的药物。然后对柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的化合物，靶点密切相关的药物进行分子对接，以评估其之间的结合情况。在 Protein Data Bank（PDB）（https://www.rcsb.org/）数据库中下载共晶复合物。随后，使用Schrödinger 软件包中的Protein and Ligand Preparation 模块在基于OPLS-2005 的力场条件下对蛋白加氢、加电荷和质子化处理，并进行能量优化。

1.3 核心基因的免疫组织化学验证

使用人类蛋白质图谱数据库(human protein atlas,HPA)(（https://www.proteinatlas.org/）中的在线工具对肝脏中的正常组织与肿瘤组织之间的ESR1 蛋白质表达水平进行免疫组织化学验证，比较在正常组织和肝癌组织中核心基因蛋白质的表达水平。

2 结果

2.1 核心靶点的筛选、验证

2.1.1 TCGA肝癌差异表达基因的识别

通过差异表达分析，筛选出了肝癌差异表达基因2703 个。其中蓝色代表下调，粉红色代表上调；热图将正常组和肿瘤组进行了划分，并且展示了显著性水平排名前50个差异基因（见补充图1）。

2.1.2 TCGA肝癌加权共表达基因的鉴定

通过函数pickSoftThreshold 选择软阈值β=3 建立了无标度网络，筛选出了8个加权基因模块，可以看出红色、蓝色、绿松石色在正常组和肿瘤组之间显著性水平排名前三，因此被用于后续的分析（见补充图1）。

补充图1 差异表达分析和WGCNA分析。

2.1.3 GEO-GSE14502 一致性聚类分析筛选出核心的模块基因

通过一致性聚类分析，我们划分了2个聚类模块，从图可以看出，GEO 模块1 和模块2 之间能够被明确的区别开来，并且当其模块数目为2 时，内部一致性（cluster consensus）大于0.8，这说明了划分聚类内部的可靠性（见补充图2）。

补充图2 一致性聚类分析

2.1.4 肝细胞癌发生发展相关基因的鉴定

通过R 语言4.0.1 的韦恩图包，我们将上述的TCGA-LIHC 的差异表达基因，加权共表达基因，GEO_CLUSTER1 和 GEO_CLUSTER2 同 其 正 常 组 织 之间的差异表达基因进行了取交集处理，共得到了890个肝细胞癌发生发展相关基因。

2.1.5 柴胡疏肝散化合物和靶点的鉴定

根据口服生物利用度（Oral B，OB）＞30%，类药性（Drug L，DL）＞0.18 的标准，共筛选出了160 个化合物，其中柴胡17个，白芍14个，川芎8个，枳壳5个，陈皮5个，甘草92个，香附19个；214个靶点（原1317个靶点，去重后得到214个），其中柴胡276个，白芍62个，川芎19 个，枳壳 52 个，陈皮 107 个，甘草 572 个，香附231个。

2.1.6 柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点鉴定

通过R 语言4.0.1 的韦恩图包，我们将上述的890个肝细胞癌发生发展相关基因和柴胡疏肝散的214个靶点取交集，共得到了柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点38个。这些靶点将被用于后续的GO 和KEGG 功能富集分析，单因素cox 分析和LASSO 回归构建预后模型，以及PPI蛋白互作网络筛选核心靶点（图1）。

图1 肝细胞癌发生发展相关基因的鉴定（A）和柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点鉴定（B）。

2.1.7 柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的GO 和KEGG 功能富集分析

通过在线的metascape数据库进行GO和KEGG 功能富集分析。条形图结果显示，GO 富集分析中，柴胡疏肝散治疗肝细胞癌可能与对无机物的反应、类固醇代谢过程和对细胞外刺激的反应有关；KEGG 富集分析中，柴胡疏肝散治疗肝细胞癌可能与FOXM1 信号通路有关。并且，我们构建了GO 和KEGG 之间的相互作用网络，以进一步了解各个生物功能以及通路之间存在的相互作用关系（图2A、图2B）。

2.1.8 PPI蛋白互作网络筛选核心靶点

通过在线的metascape 数据库进行PPI 蛋白互作网络分析，根据蛋白之间的相互作用和功能聚类。将38 个靶点进行了划分，此网络包括了38 个点，163 条边，共得到了2 个聚类模块，分别为PPI 模块1：GSTM1， CYP1A1， CYP1A2， CYP3A4， SULT1E1，AKR1C3；PPI 模块2：ESR1，JUN，AR，FOS。这些靶点被认为核心的靶点，将用于后续的分析（图3）。

图3 PPI蛋白互作网络筛选核心靶点

2.1.9 疾病-药物-化合物-靶点网络筛选核心靶点

通过cytoscape3.7.2，我们纳入了柴胡舒肝散对肝细胞癌有治疗作用的化合物和靶点，构建疾病-药物-化合物-靶点网络。此网络包括了133 个点，347 条边。可以看出，PTGS2，AR，CCNA2，CHEK1，ESR1，F7，ADRB2，MAOB，NR3C2，JUN 是与化合物相互作用数目最多的前10 个靶点，来自甘草，香附的MOL000098（槲皮素），来自白芍，柴胡，香附的MOL000422（山奈酚），来自柴胡，香附的MOL000354（异鼠李素）是与靶点相互作用数目最多的前3个化合物（图4A）。

图4 疾病-药物-化合物-靶点网络筛选核心靶点（4A）和柴胡疏肝散治疗肝癌“病-症-方/药”网络（4B）

2.1.10 柴胡疏肝散治疗肝癌的“病-证-方/药”网络构建

在SymMap 数据库导入柴胡疏肝散治疗肝癌的化合物或靶点，保留了疾病-药物-化合物-中医症状-现代医学症状均有对应关系的点，从而构建肝郁气滞型肝癌“病-证-方/药”网络（图4B）。可以看出，柴胡疏肝散治疗肝郁气滞证肝癌的网络，患者可能出现发热、头痛、呕吐、口干、症瘕、黄疸等既与少阳证候相关、又与肝癌相关的症状。

2.1.11 核心靶点的鉴定与生存分析

为了鉴定最终的核心靶点，通过R 语言4.0.1 的韦恩图包，将疾病-药物-化合物-靶点网络筛选的10 个核心靶点和PPI 蛋白互作网络筛选的10 个核心靶点进行取交集处理，得到了最终的三个靶点，分别为：ESR1，JUN 和 AR。KM 生存分析显示，ESR1 和 JUN 基因在生存分析中具有显著性意义。ESR1 高表达的肝细胞癌患者生存率更高，JUN 基因高表达的肝细胞癌患者生存率更差，其差异具有显著性意义，对秩数检验的P值分别为0.036和0.00069（图5）。

图5 核心靶点的鉴定与生存分析

2.2 预后模型及列线图的构建

2.2.1 单因素cox 分析和LASSO 回归构建柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的预后模型

通过对柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点38 个进行单因素cox 分析，结果显示（图6A），有18 个基因与生存显著相关，并且这18个基因危险比都没有跨越1，这说明了结果良好。进一步使用了18 个基因进行LASSO 回归去除了冗杂因素，以7 个基因构建了预后模型，其模型公式为：(0.1165)*CCNB1 + (-0.0396)*PON1 + (0.0888)*CHEK1 + (0.0521)*SPP1 + (0.0093)*NQO1 + (0.0102)*SERPINE1 + (0.0012)*IGFBP3。结果显示，模型的低危险组中位生存期为6.9 个月，高危险组中位生存期为3.1 个月，其差异具有显著性意义，P=6.71e-07（图6）。预后模型的ROC曲线计算了AUC面积，分别为1年0.789，3年0.697，5年0.677,这说明了柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点构建的预后模型用以预测患者生存具有良好的效应。

图6 柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的预后模型构建

2.2.2 构建列线图用以评估患者的总体生存情况

结合年龄，性别，TNM分期和ESR1，JUN基因的表达，使用了单因素cox 分析筛选出了预后相关因素，结果显示ESR1，T，M分期是预后相关因素。进一步的多因素cox 分析结果表明ESR1 和T 分期是独立的预后危险因素，然后使用ESR1 和T 分期构建了列线图，用以评估患者的总体生存情况，其C-index 为：0.622（0.555-1），P＜0.001，表 明 了 具 有 良 好 的 预 测 能力（图7）。

图7 构建列线图用以评估患者的总体生存情况

2.2.3 药物敏感性分析及分子对接

通过癌症药物敏感性的基因组学数据库，我们鉴定了与ESR1 密切相关的两种药物，分别为Tamoxifen（他莫昔芬）和Fulvestrant（氟维司群），其IC50 最低分别为 9.29 μL、12.9 μL，AUC 最高分别为 0.987、0.980。这说明了极低剂量的他莫昔芬和氟维司群能对ESR1起到很好的靶向作用，并且此两者在体内都能很好地进入循环系统（图8）。为了验证活性小分子Isorhamnetin、Tamoxifen和Fulvestrant对蛋白（ESR1）的结合情况。在Protein Data Bank（PDB）数据库中下载共晶复合物（ESR1 ID: 3ocb）。随后，使用Schrödinger软件包中的Protein and Ligand Preparation 模块在基于OPLS-2005 的力场条件下对蛋白加氢、加电荷和质子化处理，并进行能量优化。从对接结果来看，Isorhamnetin、Tamoxifen 和 Fulvestrant 和蛋白 ESR1 的结合效果良好。ESR1 的结合能与他莫昔芬、氟维司群非常接近，这也提示了异鼠李素可能成为潜在的ESR1靶向药物（图9、表1）。

图8 ESR1药物敏感性的IC50及AUC

表1 ESR1 与 Isorhamnetin、Tamoxifen 和 Fulvestrant 的分子对接评分

图9 ESR1与Isorhamnetin、Tamoxifen和Fulvestrant的分子对接

2.3 免疫组织化学染色结果

通过HPA 数据库进行免疫组织化学染色，结果显示，ERS1 表达水平在正常组织中高于肿瘤组织，在肿瘤组织中不能检测得到（图10）。这与我们的生存分析一致，进一步说明ESR1 高表达在肝癌中是预后保护的因素。

图10 正常肝脏组织与肝细胞癌组织中ERS1的蛋白质表达水平

3 讨论

肝癌是常见的消化道肿瘤之一，其发病率在我国恶性肿瘤中排名第4 位，死亡率位于恶性肿瘤的第2位[1]，对国民生命健康造成严重的威胁。目前肝癌的治疗以手术切除为主，有研究报道其5 年复发率超过70%[26-27]，患者预后情况不佳。柴胡疏肝散源于《景岳全书》[28]，是临床治疗肝郁气滞的主要方剂。柴胡疏肝散治疗肝癌已被广泛报道，但是其分子机制仍然需要进一步研究。因此，本研究旨在揭示柴胡疏肝散治疗肝癌在分子层面的机制以及构建预后模型和列线图，以期为临床治疗肝癌的进展提供可靠依据。

本研究基于生物信息学分析方法，在TCGA 数据库中筛选得到肝细胞癌的差异表达基因2703个，加权共表达基因9810 个，在GEO 数据库中获得GEO 模块差异表达基因1 4404 个，GEO 模块差异表达基因2 5320 个。将上述四个模块取交集得到与肝细胞癌发生发展密切相关基因890 个。从TCMSP 数据库得到柴胡疏肝散靶点的214 个，将柴胡疏肝散的靶点与肝细胞癌发生密切相关的基因进行取交集处理，得到药物-疾病共同靶点38个。

为了研究柴胡疏肝散治疗肝癌靶点的作用机制，对筛选出的38 个药物-疾病靶点进行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。GO 功能富集结果显示，柴胡疏肝散治疗肝癌可能与对无机物的反应、类固醇代谢过程及对细胞外刺激反应等有关。KEGG 通路富集分析结果显示，柴胡疏肝散治疗肝癌可能与FOXM1 信号通路有关。研究表明，FOXM1信号通路通过调节细胞核基因表达，清除凋亡上皮细胞，与细胞的代谢过程有关[29]。胡国辉[30]研究发现FOXM1 信号通路通过激活下游KIF4A 启动子，调节细胞有丝分裂，从而促进肝癌细胞的增殖。有研究[31]显示，在FOXM1信号通路中，FOXM1 的上调可以激活 p38MAPK/NF-κB 通路，进而介导炎症反应的发生，可能与对细胞外刺激反应有关。这提示了柴胡疏肝散可能通过作用FOXM1 通路，调节其异常表达从而抑制肿瘤细胞的增殖。

为了筛选得到与肝细胞癌密切相关的核心靶点，结合PPI 蛋白互作网络和疾病-药物-化合物-靶点网络所筛选核心靶点取交集，最终得到3个核心靶点，分别为：ESR1、JUN、AR。生存分析发现，JUN、ESR1 在高低风险组中具有显著差异性。其中，JUN 低表达与良好预后呈相关性，ESR1 的高表达与良好预后呈相关性。ESR1 是一种配体激活的转录因子受体，有研究表明[32]其通过抑制JAK、STAT 通路可以显著抑制肿瘤细胞的增殖。临床研究显示[33]ESR1 通过调节下游靶基因在肝癌细胞中的表达，影响肝癌细胞的迁移能力，ESR1对肝癌的进展有重要临床意义。JUN 是细胞核内的重要转录因子，c-jun 的异常高表达已被证实与肝细胞癌的发生有关[34]。相关研究[35]发现c-jun 可以保护紫外线诱导的细胞凋亡，抑制TNF-α 诱导的凋亡，促进肝癌细胞增殖和免疫逃逸[36]。AR 是一种核蛋白受体，可以雄激素特异性结合，调节基因表达水平，诱导细胞增殖生长[37]。蒋广宜[38]研究发现，AR 通过抑制PD-L1 表达而干扰T 细胞，使得肝癌细胞获得免疫逃逸。

在SymMap 数据库导入柴胡疏肝散治疗肝癌的化合物或靶点，保留了疾病-药物-化合物-中医症状-现代医学症状均有对应关系的点，从而构建肝郁气滞型肝癌“病-证-方/药”网络。从柴胡疏肝散治疗肝郁气滞证肝癌的网络可得，患者可能出现发热、头痛、呕吐、口干、症瘕、黄疸等既于少阳证候相关、又与肝癌相关的症状。

构建柴胡疏肝散治疗肝癌的靶点预后模型，对预测肝癌患者预后评估具有临床意义。KM 生存分析结果显示，高低风险组间生存情况具有显著差异，低风险组与良好生存情况相关。随着风险评分的增加，患者的死亡人数不断增加。此外，进一步使用ROC 回归曲线验证了该模型的准确性，其AUC 面积分别为1 年0.789，3年0.697，5年0.677，说明该模型预测肝癌患者预后具有良好效应。因此，柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点预后模型在预测患者预后中具有可靠性。

为进一步获取独立的预后因子，对肝细胞癌生存相关靶点结合性别、年龄、TNM 分期进行单因素及多因素cox分析。结合单因素cox和多因素cox分析结果可知，ESR1、T 分期是独立的预后危险因素。进一步构建列线图以估算ESR1、T 分期的表达水平与患者总体生存率的关系，结果显示其c-index 为0.622（0.555-1），P＜0.001，说明该列线图用以评估患者的总体生存情况具有中等程度的准确性。

为了评估ESR1 和核心化合物、相关敏感性药物的优劣情况，使用了分子对接模拟核心其相互之间的结合稳定情况[39]，分子对接评分为负值说明结合，正值说明不结合，负值越大说明结合效果越好。结果显示，Isorhamnetin、Tamoxifen 和 Fulvestrant 和蛋白 ESR1的分子对接评分均为负值，结合效果良好，ESR1 的结合能与他莫昔芬、氟维司群非常接近，这也提示了异鼠李素可能成为潜在的ESR1 靶向药物。异鼠李素是银杏、沙棘等植物中提取的黄酮类化合物[40]，蒋晨春等[41]进行研究发现，异鼠李素可以诱导肝癌细胞凋亡，抑制其进入细胞DNA 复制期，具有一定的抗肝癌作用。异鼠李素在阻滞肝癌细胞周期中，多种细胞周期蛋白表达下降，阻滞作用可能与细胞内活性氧水平相关[42]。此外，有研究[43]证实，异鼠李素与抗胃癌药物联合使用，可以增强药物疗效。

为了检验ESR1 在肝细胞癌中的表达情况，借助HPA 数据库对肝脏组织进行免疫组织化学染色。结果显示，肝细胞癌组织中ERS1 蛋白质表达水平低于正常肝细胞组织，进一步说明了ESR1 高表达是预后的保护因素。

中药复方治疗肝癌作用机制复杂，利用网络药理学方法可对其机制进行分子层面的进一步研究。谢小慧等[44]基于网络药理学研究发现健脾消积方中的槲皮素、木犀草素等是药效成分的重要组成，发挥调控诱导肝癌细胞凋亡的作用。何灿封等[45]通过探讨参桃软肝丸治疗肝癌的机制发现槲皮素、木犀草素及山奈酚可能是发挥作用机制的有效成分，通过利用网络药理学分析方法，寻找作用靶点与通路可推动肝癌发生机制认识及新药研发，体现了中药复方治疗肝癌多成分、多靶点、多通路的特点。

本研究结合网络药理学、分子对接和生物信息学分析方法，研究柴胡疏肝散治疗肝癌的分子靶点以及构建预后模型。根据研究得出结论：①异鼠李素可能是柴胡疏肝散治疗肝细胞癌发挥作用的主要成分之一；②柴胡疏肝散治疗肝细胞癌的靶点构建的预后模型可用以用于患者预后的评估；③根据ESR1 的表达水平、T 分期构建的列线图可用于患者总体生存率的估算，效能良好。