木犀草素纳米乳清除超氧阴离子研究

2022-08-26胡泽香佟雷耿艳萌杨琦谢舒侯甲福牡丹江医学院黑龙江牡丹江157011

化工管理 2022年23期

胡泽香，佟雷，耿艳萌，杨琦，谢舒，侯甲福(牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157011)

0 引言

木犀草素(Luteolin)是一种黄酮类化学物质[1]，广泛分布于自然界中，例如金银花、菊花、白猫夏枯草等传统中药中[2]。具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[3]，在临床多应用在止咳、祛痰、消炎方面[4]。黄酮类化合物因其化学结构具有很强的抗氧化活性[5]，起主要作用的就是酚羟基的取代基位置和数目，尤其是B环的邻二酚羟基[6]。木犀草素应具有抗氧化活性[7]。但由于木犀草素在热水中微溶，在冷水中不溶，从根本上限制了木犀草素的应用。纳米乳是由水相、油相和乳化剂组成的一种溶液体系，可提高水难溶性药物成分的溶解度，同时体系中具有高度分散的小液滴，在体内分布快，药效高，可以极大地提高药物吸收速度来发挥药效，来提高生物利用度，本实验将木犀草素制备成水包油型纳米乳来克服水溶性差的特点，文章主要从木犀草素纳米乳清除超氧阴离子自由基方面来研究其抗氧化活性，并以VC作为阳性对照。

1 材料与仪器

1.1 材料

木犀草素(上海泰坦科技股份有限公司)；盐酸溶液(哈尔滨试剂化工厂)；维生素C片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；Tris-Base(飞净科研试剂)；邻苯三酚(天津市大茂化学试剂厂)；乙酸乙酯(天津市富宇精细化工有限公司)；Tween-80(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)。

1.2 仪器

紫外可见分光光度计(江苏省苏州市新区华山路145号)；高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)。

2 实验方法

2.1 超氧阴离子自由基清除能力的测定

邻苯三酚自氧化-分光光度法可以用来初步筛选食品行业的抗氧化剂，也可以对清除超氧阴离子自由基的能力进行评价[8]。邻苯三酚的自氧化过程是链式反应，在碱性条件下可以自氧化生成超氧阴离子自由基[9]。邻苯三酚在pH值＜9的条件下其自氧化速率与生成的超氧阴离子自由基的浓度成正相关。通过紫外分光光度计测量木犀草素对超氧阴离子自由基的清除作用来间接描述木犀草素的抗氧化活性[10]。

2.1.1 溶液配制

(1) Tris溶液配制：准确称取1.211 4 g Tris固体，蒸馏水溶解后定容至100 mL，得浓度为0.1 moL/L Tris溶液。

(2) Tris-HCl溶液配制：将Tris溶液50 mL与0.1 moL/L HCl溶液22.9 mL混合，加蒸馏水将体积调至100 mL，得浓度为50 mmoL/L Tris-HCl溶液。

(3)邻苯三酚溶液配制：准确称取邻苯三酚0.037 8 g, 10 mmol/L HCl溶解后定容至100 mL，得浓度为3 mmoL/L邻苯三酚溶液。

(4) HCl溶液配制：准确称取10 mL的0.1 mol/L HCl溶液，蒸馏水溶解后定容至100 mL，得浓度为10 mmol/L HCl溶液。

(5)木犀草素纳米乳配制：将乙酸乙酯、蒸馏水、tween-80、无水乙醇四种组分按照不同的比例加入烧杯中，加入4 mg木犀草素，搅拌混合之后共100 mL。用超声波细胞粉碎机进行超声，最终形成木犀草素纳米乳。分别取 10、9、8、7、6、5 mL 木犀草素溶液置于试管，加入无水乙醇定容至10 mL，得到溶液的浓度分别为 0.040、0.036、0.032、0.028、0.024、0.020 mg/mL。

(6) VC溶液配制：准确称取9.8 mg VC粉末，蒸馏水溶解后定容至100 mL。分别取10、9、8、7、6、5 mL VC溶液置于试管，加入蒸馏水定容至10 mL，得到溶液的浓度分别为 0.040、0.036、0.032、0.028、0.024、0.020 mg/mL。

2.1.2 操作步骤

(1)邻苯三酚自氧化速率测定。试管中加入Tris-HCl缓冲液4.5 mL，再加入4.2 mL蒸馏水，混和之后进行水浴加热[11]。设置温度为25 ℃，20 min取出之后，马上加入0.3 mL相同温度下已经预热好的邻苯三酚[12]，混合均匀之后开始计时。波长设为325 nm，吸光度值每隔30 s记录一次，时间为4 min。以10 mmol/L HCl溶液代替邻苯三酚溶液作为空白管[13]。横坐标是时间，纵坐标是吸光度值，做出的曲线斜率为邻苯三酚自氧化的反应速率K0。

(2)木犀草素纳米乳对邻苯三酚自氧化速率的影响。试管中加入Tris-HCl缓冲液4.5 mL，再加入4.2 mL木犀草素纳米乳，混和之后进行水浴加热。设置温度为25 ℃，20 min取出之后，马上加入0.3 mL相同温度下已经预热好的邻苯三酚，混合均匀之后开始计时。波长设为325 nm，吸光度值每隔30 s记录一次，时间为4 min。以10 mmol/L HCl溶液代替邻苯三酚溶液[14]，以无水乙醇4.2 mL代替木犀草素纳米乳作为空白管。横坐标是时间，纵坐标是吸光度值，做出的曲线斜率记为K1。然后按照下列公式计算清除率。

式中：K0为加入蒸馏水后邻苯三酚溶液的吸光值随时间的变化率；K1为加入不同浓度木犀草素纳米乳后邻苯三酚溶液的吸光值随时间的变化率。

(3) VC对邻苯三酚自氧化速率的影响。试管中加入Tris-HCl缓冲液4.5 mL，再加入4.2 mL VC溶液，混和之后进行水浴加热。设置温度为25 ℃，20 min取出之后，马上加入0.3 mL相同温度下已经预热好的邻苯三酚，混合均匀之后开始计时。波长设为325 nm，吸光度值每隔30 s记录一次，时间为4 min。以10 mmol/L HCl溶液代替邻苯三酚溶液，以蒸馏水4.2 mL代替VC溶液作为空白管。横坐标是时间，纵坐标是吸光度值，做出的曲线斜率记为K2。然后按照下列公式计算抑制率：

式中：K0为加入蒸馏水后邻苯三酚溶液的吸光值随时间的变化率；K2为加入不同浓度VC溶液后邻苯三酚溶液的吸光值随时间的变化率。

3 结果与分析

3.1 清除超氧阴离子自由基的能力

以VC为对照，不同浓度的木犀草素纳米乳对超氧阴离子自由基的清除率如图1所示。由图1可以看出木犀草素纳米乳对超氧阴离子具有清除作用，其清除作用效果与木犀草素纳米乳浓度在一定范围内呈正向关系，木犀草素纳米乳清除超氧阴离子自由基的能力稍弱于VC。在0.02～0.04 mg/mL 的有效范围内，随木犀草素纳米乳浓度的不断增加，清除率也随之不断增加。可以看出木犀草素纳米乳浓度越大，其对超氧阴离子的清除力越高。

图1 木犀草素对超氧阴离子自由基的清除作用

作为一种特殊的金属酶，超氧化物歧化酶(SOD)可以与超氧阴离子自由基发生反应，从而对其进行清除[15]。经典的邻苯三酚法是Marklund等第一次研究出了邻苯三酚法来测定SOD活性[16]。邻苯三酚在碱性条件下可以迅速氧化产生超氧阴离子而生成中间产物，随着时间的延长，吸光度值增加，二者之间呈线性关系。该法简单快速，重复性很好[17]。

3.2 木犀草素的抗氧化作用

当氧气与体内某些物质发生化学反应时，会生成对人类有害的活性氧和自由基[18]。活性氧和自由基会破坏生物大分子的结构，引起DNA的突变，破坏生物大分子的的膜结构和功能蛋白，由此加速机体的老化和损伤，甚至会使癌症、恶性肿瘤的发生率增加[19]。木犀草素本身具有还原性，可作为氢供体给自由基提供氢原子[20]。主要作用于酶类抗氧化系统，增强机体内抗氧化酶系统的活性，对抗氧自由基、活性氧等发挥抗氧化作用[21]。此外，木犀草素还可以增强生物体内抗氧化酶系统的活性[22]。Rooban等[23]发现超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)两种酶，在被亚硒酸盐诱导之后活性会降低，但是木犀草素可以缓解并可以增加其活性。Ashokkumar P等研究发现木犀草可以提高维生素A、维生素C和维生素E的含量，而这三种维生素是参与机体内清除氧自由基的重要物质。木犀草素还能通过增强谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性来起到抗氧化的作用[24]。木犀草素虽有抗氧化活性，但其不表现为促氧化，可以很好地清除自由基[25]。