麦粒灸干预甲状腺功能减退大鼠免疫应答的实验研究

韩效 屈玉明 郝重耀 张天生 赵季宇 王红阳

甲状腺功能减退(以下简称“甲减”)是因多种原因致甲状腺激素产生释放障碍或生理效应降低,引发机体全身性代谢降低的一种综合证候[1]。各年龄段皆可见,好发于女性群体,患病率为17.8%[2]。甲减对机体的负面影响涉及生长发育、生活质量、学习记忆等诸多方面,免疫内环境紊乱是其不良链条的重要一环[3]。多项研究表明,甲状腺自身抗体和炎症因子介入了甲减的病程中并影响着甲状腺功能活动[4-7]。

艾灸作为传统的中医疗法,能温经散寒、祛风除湿、温阳益气,适用于虚寒性疾病及久病体虚者。研究证明,艾灸可缓解甲减的症状,提升甲状腺素血清浓度[8-9]。麦粒灸作为艾灸的一种,操作简单,病患痛苦小,易于推行。本实验采取丙硫氧嘧啶(propyl-thiouracil,PTU)灌胃的方法构建甲状腺功能减退大鼠模型[10],通过观察麦粒灸对自身免疫应答的影响,探讨麦粒灸对甲减大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康4～6周龄SPF级SD大鼠30只(雌雄各半),体质量160～180 g,购自北京斯贝福生物技术有限公司,许可证编号:SCXK(京)2019-0010。实验已获得山西省针灸研究所生物医学研究伦理委员会的准许(伦理科2020第003号)。

1.2 药品与试剂

PTU为50 mg/100片,上海朝晖药业有限公司,批号:2008N18;石蜡、甲醛,上海国药集团,批号:690189691,10010018;广谱二抗、DAB浓缩型试剂盒,上海长岛生物技术有限公司,批号:D-3004、FL-6001;苏木素,BASO公司,批号:714094;大鼠游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)、促甲状腺素(thyrotropin,TSH)试剂盒(货号:SU-B31011、SUB31010、SU-B30271);甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroglobulin antibodies,TGAb)试剂盒(货号:SU-B30541、SU-B30542);干扰素(interferonγ,IFN-γ)、白介素10(interleukin 10,IL-10)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)试剂盒,批号:SU-B30194、SU-B31073、SU-B30173,均购于WKSUBIO公司。

1.3 仪器与设备

正置显微镜,OLYMPUS公司,型号:CX41;石蜡切片机,徕克公司,型号:SQ2125;摊片机,徕克公司,型号:PPTHK-21B;水浴锅,Leica公司,型号:HI1210;数码相机,NIKON公司,型号:D5100;移液器(吉尔森P型移液器),PiPetman;酶标仪,Rayto公司,型号:RT-6100;恒温烤箱,上海恒一公司。

1.4 分组、模型制备及干预

适应性饲养7天后,依照随机数字表法将30只SD大鼠平均分为空白组、模型组和麦粒灸组。将PTU研碎后配置成0.1%的PTU混悬液,灌胃剂量为1 mL/100 g[10]。空白组以生理盐水灌胃,其余两组予PTU灌胃,各组等量同时操作,每日一次,先连续灌胃4周。四周后,模型组和麦粒灸组继续给予0.1%的PTU(因停药后,大鼠甲状腺功能状态渐渐恢复,所以治疗期间仍以PTU维持甲减状态),剂量为10 mg/1 kg;空白组按1mL/100 g予等剂量生理盐水,隔日一次,各组再连续灌胃4周。每周称重换算以调整给药剂量。

1.5 干预方法

把纯艾绒用定制麦粒灸模具制成基底部2.5～3.0 mm,高度为4～5 mm的麦粒柱,于大鼠的大椎、命门、肾俞(双)、脾俞(双)处施灸,每个麦粒燃烧时间10～12秒,隔日一次,连续干预4周。取穴参照《实验针灸学》[11],并结合动物比较学方法进行。

1.6 标本采集及指标检测

1.6.1 实验前后测量大鼠体质量 于适应性期饲养后、造模期后、干预期后用电子天平称重,记录三组大鼠体质量。

1.6.2 测量脾脏、胸腺质量及脏器指数 依体质量计算水合氯醛(0.3 mL/100 g)剂量麻醉大鼠,经腹主动脉取血于采血管,静置30分钟离心取上清液。将甲状腺组织放入4%多聚甲醛固定液中;取脾脏、胸腺,用0.9%氯化钠溶液清洗干净,滤纸吸干后电子天平称重,计算脏器指数(器官重量/体重)。

1.6.3 甲状腺病理组织观察 将甲状腺于固定液中取出,各浓度乙醇逐级脱水,50%酒精+二甲苯透明,浸蜡包埋切片备HE染色,拍照采集切片标本。

1.6.4 血清细胞因子表达测定 将血清样品解冻后混匀,按照ELISA试剂盒操作步骤严格进行,最后用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(optical density,OD),计算甲状腺功能(FT3、FT4、TSH)、自身抗体(TPOAb、TGAb)以及炎症因子(IFN-γ、TGFβ1、IL-10)浓度。

1.6.5 免疫组化染色组织 将甲状腺切片组织脱蜡水化,于柠檬酸钠中高压修复后洗涤,加H2O2湿盒孵育后继续洗涤;加非免疫、正常羊血清封闭非特异性抗原,湿盒孵育后PBS洗净,滴加一抗孵育过夜。取出后室温放置40分钟,PBS洗涤后加HRP标记二抗(兔抗)孵育,DAB染色,自来水冲洗,苏木精复染,酒精分化脱水,二甲苯透明后中性树胶封片,拍照采集分析,计算炎症因子的平均光密度值(average optical density,AOD)。

1.7 统计学方法

数据结果运用SPSS 25.0统计软件进行分析,实验结果为计量资料,以均数±标准差(±s)表示。所有计量数据检验后均符合正态性分布,经方差齐性检验,如方差齐,各组间比较选择单因素方差(One-way ANOVA)分析;若方差不齐,则各组间比较选用韦尔奇(Welch)或布朗(Brown)检验;组间两两比较采取t检验,以P＜0.05认为存在统计意义。

2 结果

2.1 麦粒灸对甲减大鼠体质量的影响

三组大鼠在实验前的体质量没有明显差异(P＞0.05);造模后,模型组和麦粒灸组大鼠较空白组体质量有大幅下降(P＜0.05)。观察大鼠行为发现,模型组和麦粒灸组大鼠出现活动迟缓、畏寒蜷卧、喜聚堆、皮肉松懈、体毛枯疏无光等状况;麦粒灸干预后,该组体质量较模型组上升(P＜0.05),大鼠体毛逐渐光亮、活动频繁,虽仍低于空白组大鼠,但与其差别无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组甲状腺功能减退大鼠实验前后体质量变化比较(±s,g)

表1 各组甲状腺功能减退大鼠实验前后体质量变化比较(±s,g)

注:与空白组同一时间相比,a P＜0.05;与模型组干预后相比,b P＜0.05。

组别 鼠只 体质量空白组10 实验前 204.53±8.59 造模后 285.28±11.12 干预后 322.93±37.13模型组 10 实验前 200.07±8.39 造模后 228.72±26.61a 干预后 227.30±30.26a麦粒灸组 10 实验前 200.40±6.84 造模后 221.23±20.26a 干预后 284.60±32.25 b

2.2 麦粒灸对甲减大鼠脾和胸腺的影响

脾脏和胸腺在较大意义上代表了机体免疫功能状态。与空白组相比,模型组和麦粒灸组的脾质量、脾指数、胸腺质量降低(P＜0.05),两组的胸腺指数较空白组有下降趋势,但无统计学差异(P＞0.05);与模型组相比,麦粒灸组脏器质量及指数无显著差异(P＞0.05)。见表2。

表2 各组甲状腺功能减退大鼠脾、胸腺质量及脏器指数比较(±s)

表2 各组甲状腺功能减退大鼠脾、胸腺质量及脏器指数比较(±s)

注:与空白组相比,a P＜0.05。

脾组别 鼠只质量(g) 指数(0.01g/g)胸腺质量(g) 指数(0.01 g/g)10 0.56±0.11 0.19±0.04 0.46±0.16 0.14±0.04模型组 10 0.33±0.03a 0.14±0.02a 0.26±0.05a 0.10±0.02麦粒灸组 10 0.38±0.08a 0.13±0.03a 0.28±0.12a空白组0.11±0.04

2.3 麦粒灸对甲减大鼠病理组织的影响

HE染色镜下见空白组滤泡较大,呈卵圆形较且均匀分布,腔内充满淡粉色胶样物质;滤泡为圆核的单层柱状上皮细胞。与空白组比,模型组则滤泡腔内胶样物减少,滤泡形态各异,散乱排列,增生较多,细胞较肥大。与模型组比较,麦粒灸组滤泡腔内胶状物增多且分布较均匀,滤泡大小较为一致,结构较清晰。见图1。

图1 各组甲状腺功能减退大鼠甲状腺组织病理学观察(HE,×200)

2.4 麦粒灸对甲减大鼠血清甲状腺功能的影响

模型组的FT3、FT4浓度较空白组有较大程度下降,TSH浓度有大幅度的升高,均存在统计学差异(P＜0.05);与模型组比较,麦粒灸组TSH浓度较大程度下降(P＜0.05),血清FT3、FT4浓度上升(P＜0.05);与空白组比较,TSH浓度无统计学意义(P＞0.05),FT3、FT4浓度显著下降(P＜0.05)。见表3。

表3 各组甲状腺功能减退大鼠血清中甲状腺功能水平比较(10只,±s)

表3 各组甲状腺功能减退大鼠血清中甲状腺功能水平比较(10只,±s)

注:与空白组相比,a P＜0.05;与模型组相比,b P＜0.05。

组别 FT3(pmol/L)FT4(pmol/L)TSH(mU/L)6.42±0.35 16.40±1.20 7.81±0.91模型组 3.37±0.56 a 6.20±0.81 a 19.10±0.85 a麦粒灸组 4.19±0.34 ab 12.94±0.81 ab 10.31±3.09空白组b

2.5 麦粒灸对甲减大鼠甲状腺自身抗体的影响

作为反映甲减免疫状态紊乱的显著指征,模型组大鼠TPOAb与TGAb含量远大于空白组(P＜0.05);虽然麦粒灸组血清TPOAb含量稍有降低趋势,但其差异与模型组相比无统计学意义(P＞0.05);TGAb水平较模型组显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 各组甲状腺功能减退大鼠血清中TPOAb和TGAb含量变化(±s)

表4 各组甲状腺功能减退大鼠血清中TPOAb和TGAb含量变化(±s)

注:与空白组相比,a P＜0.05;与模型组相比,b P＜0.05。

组别 鼠只 TPOAb(U/mL) TGAb(IU/mL)10 7.44±1.70 35.45±6.55模型组 10 13.65±1.40 a 90.40±10.25 a麦粒灸组 10 12.99±1.37 a 72.23±13.22空白组b

2.6 麦粒灸对甲减大鼠血清细胞因子表达的影响

与空白组相比,模型组IFN-γ及转换因子浓度明显升高(P＜0.05),血清IL-10浓度显著下降(P＜0.05);麦粒灸组血清IFN-γ、TGF-β1含量较模型组有所下降(P＜0.05),血清IL-10含量有所上升(P＜0.05)。对比空白组,麦粒灸组血清IFN-γ、TGF-β1浓度水平较高(P＜0.05),IL-10血清浓度水平较低(P＜0.05)。见表5。

表5 各组甲状腺功能减退大鼠血清中免疫因子表达程度比较(10只,±s)

表5 各组甲状腺功能减退大鼠血清中免疫因子表达程度比较(10只,±s)

注:与空白组相比,a P＜0.05;与模型组相比,b P＜0.05。

组别 IFN-γ(pg/mL)TGF-β1(ng/mL)IL-10(pg/mL)517.99±160.62 41.44±8.60 50.02±5.15模型组 1623.92±201.47 a 86.15±8.24a 27.20±8.76a麦粒灸组 1218.95±220.10 ab 75.53±3.32ab 38.87±5.62空白组ab

2.7 麦粒灸对甲减大鼠组织因子AOD值的影响

模型组IFN-γ的AOD高于空白组(P＞0.05),但差异无统计学意义,其TGF-β1的AOD值与空白组差异比较无统计学意义(P＞0.05),IL-10的AOD值显著低于空白组(P＜0.05)。与模型组相比,麦粒灸组IFN-γ、IL-10的AOD值显著低于模型组(P＜0.05),TGF-β1的AOD值与模型组的差异比较无统计学意义(P＞0.05)。如表6。

表6 各组甲状腺功能减退大鼠甲状腺中免疫因子的AOD值变化(10只,±s)

表6 各组甲状腺功能减退大鼠甲状腺中免疫因子的AOD值变化(10只,±s)

注:与空白组相比,a P＜0.05;与模型组相比,b P＜0.05。

组别 IFN-γ IL-10 TGF-β 1 0.234±0.032 0.308±0.007 0.346±0.003模型组 0.269±0.008 0.278±0.014a 0.311±0.009麦粒灸组 0.208±0.020b 0.241±0.001ab 0.291±0.021空白组a

免疫组化结果显示:大鼠甲状腺组织中IL-10、IFN-γ和TGF-β1阳性颗粒体主要表现为棕黄色,存在于甲状腺滤泡细胞的胞浆中。三种免疫因子在甲状腺组织中表达差异性较大。空白组IL-10和TGF-β1阳性颗粒体染色深,表达多,范围广;而IFNγ阳性颗粒体则染色较浅,表达较少,范围较小。模型组甲状腺上皮细胞IFN-γ阳性颗粒体染色更深,表达更多,范围更大;但是其IL-10、TGF-β1阳性颗粒体染色较浅,表达更少,范围更小。麦粒灸组甲状腺上皮细胞IFN-γ、TGF-β1及IL-10阳性颗粒体均染色更浅,表达更少,范围更局限。如图2～4所示。

图2 各组甲状腺功能减退大鼠甲状腺组织中IFN-γ的IHC表达状况(DAB×200)

图3 各组甲状腺功能减退大鼠甲状腺组织中TGF-β1的IHC表达状况(DAB×200)

图4 各组甲状腺功能减退大鼠甲状腺组织中IL-10的IHC表达状况(DAB×200)

3 讨论

现代研究表明,麦粒灸作为直接灸穴的理疗方法,对多种慢性炎症疾病的免疫功能有着良性调节作用[12-13]。它的治疗原理主要是利用艾柱燃尽时那种短暂、快速、强烈的烧灼皮肤的持续性局部炎症反应,“以火促通”,促进机体发生良性的免疫反应[14]。甲状腺功能减退作为一种免疫微环境紊乱的慢性病[15],麦粒灸干预甲减疾病的免疫应答的实验研究较少。

细胞免疫因子的表达与甲状腺功能的表达息息相关,同时参与了甲状腺疾病的病理变化[16]。免疫因子的异常表达不仅造成了甲状腺素的分泌和作用失常,而且也引起了生物体的免疫内环境失调[17]。本实验结果证实,麦粒灸能够提高血清FT3、FT4的水平(P＜0.05),降低TGAb的含量(P＜0.05),证明麦粒灸对甲状腺有一定的保护作用,展示了艾灸调节免疫失衡的优势。为深入研究艾灸对甲减生物体的保护作用,因而观察麦粒灸对T细胞和B细胞因子的作用。

研究发现,甲状腺功能减退患者TPOAb、TGAb及 细 胞 因 子IL-10、IFN-γ、TGF-β1异 常 表 达。TPOAb、TGAb经B细胞产生,介导体液免疫,主要以IgG1、IgG2及IgG4构成,通过抗体依赖性的细胞毒作用,破坏甲状腺滤泡上皮细胞[18],损伤甲状腺组织。IFN-γ主要由Th1细胞分泌,能够让CD8+T细胞对甲状腺细胞产生免疫反应;也可以活化并增殖甲状腺组织内的T细胞,扩大免疫反应;IFN-γ表达增多可以抑制钠碘转运体,降低摄碘率[19]。Treg细胞释放的TGF-β1,能干预淋巴细胞的增殖,保证免疫内环境有序循环。IL-10是一种免疫抗炎因子,能够抵抗T细胞激活[20],拮抗Th1促炎因子的表达。有研究就证明,亚临床甲减病与IL-10、TGF-β1异常表达密切相关[20]。本研究结果发现,与空白组相比,模型组TPOAb、TGAb滴度升高,血清IFN-γ和TGF-β1表达增强,IL-10表达减弱,其可能借由促进T细胞和B细胞介导的免疫应答在甲减病程中发挥作用。麦粒灸干预后,TGAb滴度下降,IFN-γ和TGF-β1表达减弱,IL-10表达增强。

免疫组化结果表明,甲状腺组织中存在轻微的免疫紊乱现象,其具体原因有待进一步研究研究。

由此表明麦粒灸可能主要通过良性调节血清中细胞和体液免疫应答发挥作用。