大分割与小分割X线放疗方案对乳腺癌MCF-7细胞lncRNA GATA6-AS1基因表达的影响

宁宁，唐启胜，杨愉晨，赵卫合，杨龙飞

1.西北妇女儿童医院病理科，陕西 西安 710061；2.空军军医大学附属唐都医院泌尿外科，陕西 西安 710038；3.西安市精神卫生中心检验科，陕西 西安 710061；4.空军军医大学附属唐都医院放疗科，陕西 西安 710038；5.空军军医大学附属唐都医院中心实验室，陕西 西安 710038

乳腺癌是最常见的女性肿瘤之一，是发生于乳腺的上皮性恶性肿瘤。放射治疗是乳腺癌治疗的主要手段之一，有研究认为乳腺癌对低剂量放射线不敏感，其中具体机制不明[1]。长链非编码RNA(lncRNA)对人类基因的表达具有重要的调控作用，能够影响肿瘤的发生、发展以及转移，对肿瘤诊断与治疗具有潜在价值。有研究发现乳腺癌组织中长链非编码RNA GATA6反义RNA 1(GATA6-AS1)表达降低，且与预后不良有关[2]。GATA6-AS1与肿瘤细胞放射敏感性间的关系尚不明确。为了研究乳腺癌更合理的放疗方式，为临床放疗选择提供依据，本研究拟探讨X线不同分割剂量放疗方案对乳腺癌MCF-7细胞增殖、细胞凋亡以及GATA6-AS1基因及其邻近基因表达产物GATA6表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 细胞培养试剂DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶与新生牛血清购自Gibco公司，CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自翌圣公司。RNA提取试剂Trizol、反转录试剂盒与SYBR green PCR mix购自Invitrogen公司。兔抗人GATA6单克隆抗体、HRP标记山羊抗兔二抗购自CST公司。

1.2 细胞与处理 人乳腺癌MCF-7细胞来源于ATCC菌种库，使用含10%新生牛血清的DMEM培养。实验分为小分割组(每次0.5 Gy，共8次)、大分割组(每次2 Gy，共2次)和对照组(无照射)。小分割组每天给予4次X线照射，每次0.5 Gy，间隔3 h照射，共8次；大分割组每天照射1次，每次2 Gy，共照射两次。两组细胞给予放射线总剂量相同，均在48 h内完成。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖 将三组乳腺癌细胞MCF-7培养至对数期后，用0.25%胰蛋白酶消化，以5×103/孔密度铺96孔细胞培养板，37°C培养箱中培养过夜。实验组按上述设定方案给予X线照射，分别于24 h、48 h和72 h后每孔中加入10μL CCK-8溶液，37℃继续培养4 h，450 nm波长检测OD值，绘制生长曲线。

1.4 流式细胞仪检测不同分割剂量照射对MCF-7细胞凋亡的影响 照射组与未照射组乳腺癌细胞MCF-7生长至对数期后，以5×105/孔密度铺6孔细胞培养板，37℃培养箱中培养过夜。实验组按上述方案给予X线照射，于48 h后用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 qRT-PCR法检测GATA6-AS1基因表达变化 乳腺癌细胞MCF-7生长至对数期后，按预定方案给予X线照射，分别于24 h与48 h后使用Trizol法提取照射组与对照组细胞总RNA，并反转录为cDNA，使用SYBR green PCR mix进行qRT-PCR检测。

1.6 Western blot法检测GATA6蛋白表达变化 乳腺癌细胞MCF-7生长至对数期后，按预定方案给予X线照射，48 h后提取照射组与对照组细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，Western blot法检测GATA6蛋白表达。兔抗人GATA6单克隆抗体(1∶1 000)，HRP标记山羊抗兔二抗(1∶2 000)。

1.7 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行数据统计学分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用Student t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小分割与大分割放射线照射对MCF-7细胞增殖的影响 将MCF-7细胞分为小分割组与大分割组，放射线总剂量4 Gy，通过CCK-8法检测24 h、48 h与72 h细胞增殖能力，发现大分割组MCF-7细胞的增殖抑制较小分割组更明显，72 h抑制率可达(57.0±8.86)%，分别与对照组及小分割组分别比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 不同分割剂量照射后MCF-7细胞的增殖活力比较(±s)

表1 不同分割剂量照射后MCF-7细胞的增殖活力比较(±s)

注：与对照组比较，a P＜0.05，与小分割组比较，b P＜0.05。

组别对照组小分割组大分割组F值P值0 h 0.98±0.09 1.02±0.14 0.99±0.11 0.06 0.94 24 h 1.21±0.15 0.92±0.13 0.84±0.10 7.96＜0.01 48 h 1.63±0.13 0.74±0.15a 0.54±0.17a 47.2＜0.01 72 h 2.01±0.15 0.75±0.17a 0.43±0.19b 170.46＜0.01细胞活力(OD450 nm)

2.2 小分割与大分割放射线照射对MCF-7细胞凋亡的影响 将MCF-7细胞分为小分割组与大分割组，放射线总剂量4 Gy，通过流式细胞仪检测照射后48 h细胞凋亡率，发现大分割法放射线照射对MCF-7细胞的凋亡促进更明显，凋亡率达到(19.07±2.38)%，小分割组凋亡率为(13.22±2.71)%，而对照组凋亡率仅为(4.81±0.40)%，差异具有统计学意义(F=84.24，P＜0.05)，见图1。

图1 流式细胞仪检测不同分割剂量照射对MCF-7细胞凋亡的影响

2.3 小分割及大分割放射线照射对MCF-7细胞GATA6-AS1基因表达的影响 qRT-PCR法检测结果表明，放射线照射能够增强MCF-7细胞中GATA6-AS1基因的表达，大分割组GATA6-AS1基因增强更明显，48 h达到对照组的(2.13±0.19)倍，与小分割组比较差异具有统计学意义(t=6.8894，P＜0.01)，见表2。

表2 不同分割剂量照射后MCF-7细胞内GATA6-AS1基因表达水平比较(±s)

表2 不同分割剂量照射后MCF-7细胞内GATA6-AS1基因表达水平比较(±s)

注：与对照组比较，a P＜0.05，与小分割组比较，b P＜0.05。

组别对照组小分割组大分割组F值P值24 h 1.00±0.00 1.16±0.07 1.33±0.14 9.94＜0.05 48 h 1.00±0.00 1.31±0.08 2.13±0.19ab 72.09＜0.01 GATA6-AS1基因FC值

2.4 小分割及大分割放射线照射对MCF-7细胞GATA6-AS1邻近蛋白GATA6表达的影响 Western blot法检测结果表明，放射线照射能够降低MCF-7细胞中GATA6-AS1邻近蛋白GATA6的表达，大分割组GATA6下调作用更明显，见图2。

图2 不同分割剂量照射对MCF-7细胞GATA6蛋白表达的影响

3 讨论

肿瘤细胞的异常增殖是乳腺癌发生发展的关键因素，放射线照射能够通过产生次级电子引起电离效应，诱发肿瘤细胞产生自由基，最终导致肿瘤细胞死亡。放疗是乳腺癌术后主要的辅助治疗手段，可以预防肿瘤复发及淋巴结转移，但放疗同时会造成正常组织的损伤，放射剂量越大，损伤越大，如何保证疗效的同时降低放疗剂量依旧是临床难题。近期大量前瞻性随机对照研究表明，采用短程大分割放疗方案治疗早期乳腺癌，具有与传统分割方案相同的疗效而不增加副反应的优点[3-4]。李金高等[5]发现总剂量相同的情况下，给予小分割方案多次小剂量照射能够抑制鼻咽癌细胞增殖，抑制效果明显优于大分割照射方案。小剂量照射被认为具有损伤小、费用低、耐受性好、可诱导机体免疫反应等优点[6]。为了探讨乳腺癌更合理的放疗方式，为临床放疗选择提供依据，本研究分别使用小分割及大分割法照射乳腺癌MCF-7细胞，然后通过CCK-8法与流式细胞仪检测两种照射法对乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响。乳腺癌的临床治疗中，常规放射线放疗剂量定义为2 Gy/次，存在人体组织的干扰；而在细胞学研究中，因细胞没有周围组织的干扰而对放射线照射更敏感，杀伤效果更强，本研究参考李金高等[5]的鼻咽癌细胞放疗方案，将2 Gy/次定义为细胞水平大分割，0.5 Gy/次定义为细胞水平小分割。CCK8实验结果发现乳腺癌MCF-7细胞对小分割低剂量照射不敏感，而大分割放射线照射对其增殖具有明显的抑制作用。采用流式细胞术进一步检测细胞凋亡发现，大分割法放射线照射对MCF-7细胞的凋亡促进也更明显，这与鼻咽癌细胞研究结果不一致。其中原因尚不清楚，ENNS等[1]认为肿瘤细胞对低剂量放射线敏感性与p53依赖的细胞凋亡信号通路有关。

为进一步探索乳腺癌细胞对小分割放疗不敏感的机制，本研究从lncRNA和蛋白表达水平方面进行了验证。lncRNA参与细胞生长、分化、凋亡以及核内物质运输等多种生物学过程，并在表观遗传、转录水平及转录后水平等多个方调控基因的表达。近年来研究表明，LncRNA的异常表达与包括恶性肿瘤在内的多种疾病的发生发展密切相关，其中GATA6的反义RNA1(GATA6-AS1)是一种新型的肿瘤抑制因子，能够抑制肺癌和胃癌细胞增殖和侵袭[7-8]。在卵巢癌、胰腺癌等组织中GATA6-AS1被认为是一种抑癌基因[9]，而在乳腺癌组织中，GATA6-AS1的作用尚不清楚，有研究认为GATA6-AS1在乳腺癌组织中表达水平降低与肿瘤体积大、临床分期晚、淋巴结转移和HER-2扩增有关，GATA6-AS1的低表达是乳腺癌预后不良的指标[2]。本研究发现在总放射剂量相同时，大分割放射线照射后乳腺癌MCF-7细胞增殖能力较小分割照射后明显降低，同时GATA6-AS1基因表达升高更明显，说明两者之间存在关联，大分割放疗方法通过某种途径诱导乳腺癌MCF-7细胞内GATA6-AS1基因表达提高，从而改善乳腺癌预后。但是GATA6-AS1基因相关蛋白表达是否存在同样的变化趋势仍是未知。GATA6蛋白是GATA蛋白家族中的一员，在胆管癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中呈高表达[10-12]。Western blot实验发现，乳腺癌细胞放疗后GATA6蛋白表达下降，且大分割放射线照射后GATA6蛋白下降更明显，这与细胞增殖能力及GATA6-AS1基因表达变化趋势一致，推测GATA蛋白也参与了低剂量放射线照射对乳腺癌细胞增殖的敏感性，具体机制有待进一步研究。

综上所述，乳腺癌细胞对大分割放射线照射更敏感，其中机制可能与GATA6-AS1升高及GATA6蛋白表达下降有关。