蝙蝠寄生刺圆属线虫新种的鉴定（圆形目莫林科）

菅 蕊，徐 真，高佳丽，吕国平，秦丽云，张 晛，剧慧栋*

（1.承德医学院，河北 承德 067000；2.河北工程大学，河北 邯郸 056038；3.石家庄学院，河北 石家庄 050035；4.河北中医学院，河北 石家庄 050020；5.石家庄市疾病预防控制中心，河北 石家庄 050010）

近年来蝙蝠作为一种人兽共患疾病病原的重要载体，越来越引起人们的重视，蝙蝠寄生线虫作为潜在的人兽共患病原需要研究。1926 年Boulenger 从埃及墓蝠体内发现一种线虫，命名为多刺组圆线虫（Histiostrongylus spinosusBoulenger，1926）。1935 年Travassos 认为该种线虫不属于组圆属（HistiostrongylusMolin，1861），因此建立了刺圆属（SpinostrongylusTravassos，1935），并将Spinostrongylus spinosus（Bou-lenger，1926）Travassos, 1935，作为刺圆属的模式种[1]。目前为止，该属线虫共报道6 种，该属的鉴定特征为：头端具头泡，并有由14～16 个尖端向后的刺构成的头领。头领后有大量环状排列的小刺。口腔小，食道短，呈棒状。雄虫：交合伞由2 个大侧叶和1 个小背叶组成。交合伞肋的排列方式为2～3型，第2 肋和第3 肋基部连接在一起，并与主干相连，肋的远端分离。第4 肋、第5 肋和第6 肋的基部连接在一起，然后与主干相连，肋的远端分离。背肋从基部垂直向后延伸。交合刺较细长，交合刺的柄部短，刃部长。具引带。雌虫：阴门位于虫体后半部。子宫为对宫型。尾端圆锥形，末端尖。寄生于翼手目动物。

本研究首先对寄生于黑髯墓蝠的线虫使用光学显微镜初步观察并绘制形态结构图，然后使用扫描电镜观察其重要结构并采集图谱确定该种属于刺圆属且为一新种，结合该线虫ITS 基因在GenBank 中的比对结果与其形态学特征，确定该种应属于刺圆属。本研究发现了一种新的潜在寄生虫病的病原，为寄生虫病的预防和诊断提供了基础资料及参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料标本采自2018 年广东省龙门县小黄蝠（翼手目蝙蝠科）Scotophilus kuhlii（Leach）（Chi-roptera，Vespertilionidae）的小肠。用80 ℃左右的热水将虫体烫直，并将线虫保存于70%酒精中。记录宿主的种名、寄生部位、采集时间和地点。透明液（乳酸:苯酚：蒸馏水：甘油=1：1：1：2）由河北师范大学生命科学学院动物系统学与分子进化实验室配制；DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 试剂盒和蛋白酶K 购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 线虫的观察、绘图及鉴定将已固定的标本用75%酒精或透明液制成临时装片，在光学显微镜和扫描电镜下，对线虫标本的各个部分进行初步的形态观察，并使用显微测微尺测量标本的重要形态学特征，并记录数据，借助可拍摄的光学显微镜和扫描电镜对线虫标本的主要形态特征进行鉴别并拍照，查阅文献，进行比对确定线虫种类[2]。模式标本保存于河北师范大学生命科学学院。

1.3 线虫ITS 基因的PCR 扩增及序列分析从70%酒精中取出1 条雌虫，分别置于不同的1.5 mL 离心管内做好标记， 用蒸馏水漂洗3～5 次，提取DNA，置-20 ℃冰箱中保存、备用。引物序列如下[2]：

NC1： 5'-AACAACCCTGAACCAGACGT-3'/NC5：5'-AATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC-3'，预期扩增片段长度约为650 bp。扩增程序如下：94 ℃5 min；94 ℃1 min、55 ℃1 min、72 ℃1 min，35 个循环；72 ℃10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。利用MegAlign 软件对测序结果及GenBank中莫林科10 种线虫的ITS 基因序列进行同源性分析。分别采用最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）构建ITS 基因系统发育树，将Amidostomoides monodon（KJ186098）和Amidostomoides acutum（KJ186097）设置为外群[3-4]，探究线虫间的亲缘关系。

2 结果与讨论

2.1 形态学观察结果该线虫的模式宿主为黑髯墓蝠（翼手目，鞘尾蝠科）Taphozous melanopogon（Tem-minck）（Chiroptera: Emballonuridae）。寄生部位为小肠，感染率为9%（解剖11 只其中感染1 只），感染强度为6 条。宿主采集地为中国广东省龙门县。模式标本中正模为1 条雄虫（HBNU-M1015），配模为1 条雌虫（HBNU-M1016），副模为2 条雌虫（HBNU-M1017）。新种以交合刺远端呈双叉状分支的特征命名。

形态特征：该线虫为小型线虫，口孔三角形，口孔周围有4 个头乳突和1对头感器。头端有一圈角质刺（图1B），共16个。角质刺分为两种，一种是末端不分叉的单刺，另一种是末端分叉的分支刺（图2A），其中背面和腹面两端为单刺，中间有两个分支刺，两侧面各有4根分支刺。食道短粗，呈花瓶状（图1A）。神经环位于食道中部，颈乳突和排泄孔与神经环在同一水平位置。颈刺从头领后开始出现并向后延伸到大约虫体前1/9 处，颈刺从前向后逐渐变小，呈环状排列，有50～70 圈（图2A 和图2C），最后由刺变为连续的纵脊（图2D 和图2E）。身体中部脊的个数为80，一直延续到尾端为66 条，此时又由脊变为突起。

其中正模（雄虫1 条）仅有尾部部分。交合伞发达，有两个大的侧叶和一个小的背叶。交合伞肋的排列为2～3，第2 肋和第3 肋基部平行，末端明显分开；第4～6 肋平行发出，末端稍微分离。第8 肋起自背肋基部，末端未达伞缘。背肋主干垂直向下延伸，近末端首先分出一细长侧支，然后分为两个短小的分支（图1C）。交合刺细长，末端有两个分叉，分叉有膜包被，交合刺长342 μm。引带为高尔夫球棒状，长58 μm（图1D）。

配模（雌虫1条）体长9.63 mm，最大体宽为356 μm，头刺长96 μm，头宽256 μm。神经环、颈乳突、排泄孔与头端的距离为198 μm。食道长365 μm，最大宽度为139 μm。阴门位于体后大约1/3 处，距尾端3.29 mm。括约肌长23 μm，宽32 μm，漏斗长49 μm，宽26 μm。虫卵长107 μm，宽87 μm（图1E）。雌虫尾部圆锥形，末端尖，肛门距尾端126 μm。

副模为2 条雌虫，体长9.21～9.86（9.53）mm，（括号内的数值为平均值，下同）最大体宽为320～372（346）μm，头刺长85～108（97）μm，头宽241～267（254）μm。神经环、颈乳突、排泄孔距头端170～213（192）μm。食道长321～387（354）μm，最大宽度为125～150（138）μm。阴门位于虫体后大约1/3 处，距尾端3.09～3.48（3.29）mm。括约肌长21～25（23）μm，宽27～35（31）μm，漏 斗 长45～52（49）μm，宽21～27（24）μm。虫卵长102～112（107）μm，宽80～92（86）μm。雌虫尾部圆锥形，末端尖（图1F 和图2F），肛门距尾端120～131（126）μm。

图1 双叉刺圆线虫光镜下的手绘图谱Fig.1 Hand drawing of Spinostrongylus bifurcus n.sp.from Taphozous melanopogon based on optical microscope

综上所述，该线虫具有刺圆属的形态特征。

Travassos 于1935 年建立了刺圆属，随后我国学者伍献文和刘建康在中国的蝙蝠体内发现一新种，命名为中华刺圆线虫（Spinostrongylus sinensisWu et Liu，1940）[5]；Lovekar 在印度的肯尼亚墓蝠体内报道一个新种，为印度刺圆线虫（Spinostrongylus indicusLovekar，1970）[6]；Trivedi 报 道 了 印 度 蝙 蝠 寄 生 刺圆属线虫3 个新种，包括寄生于印度山蝠小肠和直肠的Spinostrongylus johnstoniTrivedi, 1990，寄生于假吸血蝠胃肠内的Spinostrongylus singhiTrivedi，1990以及寄生于长臂墓蝠小肠的Spinostrongylus priceiTrivedi，1990[7]。到目前为止，该属线虫共报道了6种。

该种线虫与S. spinosus的主要区别为前者的交合刺末端分为2 支，而后者交合刺末端尖，不分支；前者的颈刺延伸至食道之后，大约为体长的1/9，而后者的颈刺仅延伸至食道末端。该种线虫与S. indicus的区别为前者交合刺末端分为2 支，而后者的交合刺末端分为3 支。S. johnstoni有头翼，具伞前乳突，交合刺上具有5 个～9 个角质环，无引带，与该种线虫有明显区别。S. singhi的两根交合刺稍不等长，头端的角质刺12 个～14 个，而该种线虫的交合刺等长，头端角质刺16 个。S.pricei的阴门位于虫体中部稍后，并有明显的阴门盖，颈刺25 环～30 环；而该种线虫的阴门位于体后1/3处，颈刺50环～70环。中华刺圆线虫是我国报道的唯一一种刺圆属线虫，但该种线虫与中华刺圆线虫有明显区别，一是前者交合刺末端分为2 支，而后者交合刺末端尖，不分支；二是该种线虫的食道呈花瓶状，而中华刺圆线虫的食道为棒状；前者的背肋先分出一个侧支，然后分为2 个短支，而后者背肋仅分为2 短支。综上所述，该种与该属其他6种线虫均有明显区别，应为一新种。

Fig.2 双叉刺圆线虫扫描电镜图谱Fig.2 Scanning electron micrographs ofSpinostrongylus bifurcusn.sp.

2.2 基于ITS基因序列的同源性及系统发育分析

2.2.1 同源性分析 对目的基因进行PCR 扩增，将得到的ITS 基因序列与GenBank 中莫林科10 种线虫的18 条ITS 基因比对后的结果显示，该线虫与上述10种线虫的同源性是32.73%～84.5%，表明莫林科线虫的ITS 基因呈遗传多样性。其中双叉刺圆线虫与细颈属、小细颈属、类细颈属线虫的同源性为32.73%～45.57%，双叉刺圆线虫与丝状奥库线虫的同源性为37.30%～37.79%，双叉刺圆线虫与广东杜瑞特线虫的同源性为84.5%，双叉刺圆线虫与蝠杜瑞特线虫的同源性为84.2%，GenBank 中尚无刺圆属的基因信息，与该线虫ITS 基因同源性最高的物种为杜瑞特线属线虫，它们之间的基因差异分别为15.5%和15.8%，明显高于杜瑞特线属中广东杜瑞特线虫与蝠杜瑞特线虫0.63%的属内基因差距，表明双叉刺圆线虫不属于杜瑞特线属，结合其形态学特征以及杜瑞特线属与刺圆属在莫林科的分类学地位，该种应属于刺圆属。

2.2.2 系统发育分析 本实验选取该线虫ITS 基因序列和GenBank 中莫林科线虫的19 条ITS 基因序列，包括2 亚科5 属11 种，选取Amidostomoides monodon（KJ186098）和Amidostomoides acutum（KJ186097）为外群。利用MEGA6.0 和MrBayes3.2 软件对20 条线虫的ITS 基因序列构建的ML 树和BI 树具有相似的拓扑结构（图3）。系统发育树分为3 个分支，其中类细颈属的斑马类细颈线虫（Nematodiroides zembrae）单独为一个分支。

细颈属的瑞士细颈线虫（Nematodirus helvetia-nus）、花苞细颈线虫（Nematodirus spathiger）、伊朗细颈线虫（Nematodirus oiratianus）、棉絮细颈线虫（Nem-atodirus battus）、丝状细颈线虫（Nematodirus filicollis）和小细颈属的骆驼小细颈线虫（Nematodirella cameli）组成一个分支。

丝状奥库线虫（Oswaldocruzia filiformis）、杜瑞特线属的蝠杜瑞特线虫（Durettenema rhinolophi）、广东杜瑞特线虫（Durettenema guangdongense）和刺圆属的双叉刺圆线虫（Spinostrongylus bifurcus）为一个分支（图3）。

ITS 基因系统发育树结果显示，双叉刺圆线虫（见图3 中*号）、蝠杜瑞特线虫与广东杜瑞特线虫组成一支（见图3 中右向大括号），表明三者有更近的亲缘关系。杜瑞特线属线虫与双叉刺圆线虫分为两个分支，广东杜瑞特线虫和蝠杜瑞特线虫ITS 基因的相似性为96%，而双叉刺圆线虫与杜瑞特线属线虫ITS 基因的相似性为82%，表明双叉刺圆线虫不应属于杜瑞特线属，基于其形态学特征以及杜瑞特线属与刺圆属在莫林科的分类学地位，该种应属于刺圆属。基于ITS 基因序列的同源性分析和系统发育分析结果，进一步证明该种归于刺圆属。又因其形态学特征与刺圆属现有的6 种均不完全相同，因此可以判断该种为刺圆属一新种，根据其交合刺的特征将该新种命名为双叉刺圆线虫（Spinostrongylus bifurcusn.sp.）。

Fig.3 基于ITS基因采用贝叶斯法（A）和最大似然法（B）构建的系统发育树Fig.3 Bayes(A)and ML(B)trees constructed using ITS rDNA sequence data of Molineidae

从本世纪初开始，由蝙蝠携带的病原造成的人类重大传染疾病事件已有多起，蝙蝠携带的病原对人畜均有潜在的感染性，虽然目前尚无蝙蝠寄生线虫感染人类的病例，但由于社会发展和环境变化等因素的影响，新发寄生虫病原不断出现，且在免疫性疾病等因素的影响下，一些病原的易感人群规模逐渐扩大[8]，导致一些人畜共患寄生虫病未得到有效控制，在局部地区存在潜在的流行风险或者已经开始蔓延[9]。广州管圆线虫病、异尖线虫病、比翼线虫病均由生食或半生食感染性虫卵或感染性幼虫的宿主或中间宿主而致病[10]。东南亚和我国的一些地区有食用蝙蝠的习惯，条件适宜的情况下就有可能造成蝙蝠寄生线虫的感染引起寄生虫病。双叉刺圆线虫这一新的潜在寄生虫病病原的发现，为人畜寄生虫病的预防和病原学检测提供了参考依据。