温敏型水凝胶包载布比卡因对延长神经阻滞时间的研究

郭 颖，郭 傲，路 畅，刘国梁，周升柱，王吉苹，石宏宇，刘铁成*

(1.吉林大学第二医院 麻醉科，吉林 长春130041；2.吉林大学第一医院 内镜中心，吉林 长春130021)

外科手术常常通过应用局部麻醉药阻断手术部位的神经传导从而达到镇痛的效果。理想的局麻药应该在具有良好的镇痛效果的同时没有局部刺激作用，致敏程度低，较高的治疗指数以及感觉阻滞远大于运动阻滞等特点，然而同时具备上述特征的理想药物是不存在的[1]。

水凝胶是一种通过物理或者化学交联的、遇水膨胀的三维立体网络结构。环境敏感水凝胶可以对类似于温度、pH、酶促反应等做出反应的智能水凝胶。我们最常用的包载局麻药的水凝胶为温度敏感型水凝胶，绝大多数的温敏型水凝胶在室温下为液体状态，在更高的温度下(譬如体温)即可转变为胶体状态[2]。为了延长单次注射局部麻醉药制剂所产生的作用时间，将临床上常见水溶性局麻药包载于可注射的、生物可降解的、温度敏感性的水凝胶中，研究坐骨神经阻滞延长的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

Pluronic F127(Sigma-Aldrich 上海贸易有限公司)；PAla-PEG-PAla(中科院生态环境高分子材料重点实验室)；PLGA-PEG-PLGA(长春圣博玛生物材料有限公司)；盐酸布比卡因(北京华奉联博科技有限公司)；弹性蛋白酶(Merck公司，德国，达姆施塔特)

1.2 实验方法

1.2.1载药水凝胶的制备 将临床常用的盐酸布比卡因(bupivacaine hydrochloride，BUP)碱化沉淀制成疏水制剂(布比卡因游离碱,bupivacaine free base，BFB)，并包载于水凝胶中。

1.2.2实验动物 从吉林大学实验动物中心购买20只体重介于260 g-320 g之间的年轻成年雄性Wistar大鼠。所有的动物实验均符合吉林大学动物保健和使用委员会批准的协议。动物被单独安置在自然光明/黑暗条件下的塑料笼子里，供应充足的食物和水。实验前预适应环境至少2周。

1.2.3大鼠坐骨神经阻滞 大鼠随机分为4组，每组5只大鼠，乙醚吸入麻醉后行坐骨神经阻滞术，分别给予：1)0.75 wt.% BUP·HCl溶液PBS(对照组)；2)0.75 wt.% BFB Pluronic F127水凝胶，称为Pluronic F127/BFB；3)0.75 wt.% BFB PAla-PEG-PAla水凝胶,PAla-PEG-PAla/BFB；4)0.75 wt.% BFBPLGA-PEG-PLGA水凝胶，标记为PLGA-PEG-PLGA/BFB。每只大鼠给予0.6 ml的药物制剂。

1.3 神经状态评估

1.3.1通过改良后的热盘试验对痛觉阻滞的有效性进行评估[3]热盘的温度设定在可以提供一个8-10 s左右的供被测试大鼠抬腿的反应时间，温度的准确性通过利用温度计来保证。被测试大鼠的后足被依次放置在热板上(先右再左)，应用秒表记录老鼠的肢体抬足反射或导致动物舔爪子的时间，即反应时间。为了避免在测试过程中发展为痛觉过敏或热损伤,我们设定30 s为截止时间。在给药前2天获得每只大鼠自身的热反应测量基线。给药后，在所选择设定的每一个时间点，每只大鼠都将测试一式3份，取平均值为热延迟时间。为了方便组间比较,我们把数据转化为最大比例效应(MPE%)使用以下方程：MPE%=[(P-B)/(C-B)]×100%。其中，P是平均基线反应时间，B为平均治疗反应时间，C是截止时间。

1.3.2运动阻滞评估具体评分标准[3]1分代表正常外观；2分表示当抬起大鼠尾巴时足背屈及脚趾完全张开；3分表示足跖屈且没有能力展开脚趾；4分表示完全丧失的背屈、跖屈的能力，及伴有步态障碍。为了比较，运动阻滞的持续时间从4分-2分，2分起开始复苏。

1.3.3坐骨神经周围组织大体解剖学和形态学大鼠在给药后第7天予以处死、解剖。收集注射水凝胶临近的坐骨神经，以及周围的肌肉组织。坐骨神经和肌肉标本用石蜡固定,HE染色。在大体解剖下，主要观察局部组织层次是否可以轻易分开，以及局部是否有显著粘连和疤痕形成。在显微镜下，局部的组织坏死以及是否有炎症细胞(包括中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)浸润均被纳入观察评估的标准[4]。

1.4 统计学方法

所有的数据描述均为平均值±标准偏差(SD)。三组水凝胶载药与对照组(BUP·HCl组)之间的组间差异分析均利用SPSS(Version 18.0，IBM Corporation,Armonk,New York)软件进行F检验。以P<0.05、P<0.01为差异有统计学意义[5]。

2 结果

将局部麻醉药物封装在水凝胶结构可以有效延长单次注射后镇痛持续时间。水凝胶在体内的存留时间是影响药物释放的重要因素。BUP·HCl组在注射给药后5 h即恢复完整的感觉功能(图1)。通过分析测定的MPE%值可以看出，Pluronic F127/BFB组(0± 100%)和PAla-PEG-PAla/BFB组(93.76%±3.96%)在5 h时与对照组(BUP·HCl组)(73.62%±8.63%)相比较组间差异具有统计学意义。在6 h，BUP·HCl组(0.01%±2.26%)和Pluronic F127/BFB(84.51%±6.85%)或PAla-PEG-PAla/BFB(51.93%±7.43%)之间的统计学意义更加显著。然而，PLGA-PEG-PLGA/BFB组在任何时间点与BUP·HCl组相比均未体现出明显的统计学差异。同样，所有大鼠在给药后即可观察到完全的运动阻滞。每隔1 h，对组间运动阻滞的评分进行分析和比较。如图2所示，当相比BUP·HCl组(2.8±0.45，1.4±0.55，1±0，1±0)，PAla-PEG-PAla/BFB的(3.8±0.45，3.2±0.58，2.8±0.58，2.4±0.58)组从3 h-6 h运动阻滞评分均显示出具有统计学意义的显著差异。PluronicF127/BFB组(2.6±0.55，2.6±0.55，1.8±0.45)在4 h-6 h之间与对照组相比下具有明显统计学差异。PLGA-PEG-PLGA组(2.5±0.58)在4 h时与对照组有显著性差异。运动阻滞持续时间的中位数PAla-PEG-PAla/BFB(9 h)几乎为BUP·HCl(5 h)的2倍，虽然仅略长于PluronicF127/BFB组(8 h)。BUP·HCl组的运动阻滞时间只持续了4 h，然后迅速恢复至基线,我们推测可能的原因是药物的再分配和/或消除作用。运动功能比痛觉功能更快恢复(图2)。在感觉和运动阻滞测试后，所有的动物完全恢复，没有观察到残留的感觉或运动障碍。

图1 注射载药水凝胶后大鼠热盘实验中的MPE

图2 注射载药水凝胶的大鼠在不同时间点的运动阻滞评分

所有大鼠均未观察到明显的神经毒性，但包载有水凝胶的组别局部肌肉组织炎症反应明显。相于比BUP·HCl组，PluronicF127组炎性细胞浸润更明显。BUP·HCl组没有观察到明显的组织学异常。PAla-PEG-PAla/BFB和PLGA-PEG-PLGA/BFB组炎症反应尤为明显，我们可以观察到明显的成纤维细胞的增生，局部组织的坏死，以及骨骼肌间炎症细胞的广泛浸润。

3 讨论

坐骨神经阻滞的评估主要从大鼠对疼痛的反应以及运动功能方面的影响[5]。所有动物注射包载有BFB的水凝胶后10 min即表现出完整的运动及感觉阻滞，也就是说，局麻药的起效时间并未受控制释放的影响。感觉复苏的顺序(由早到晚)为BUP·HCl>PLGA-PEG-PLGA/BFB>PAla-PEG-PAla/BFB>Pluronic F127/BFB。在热盘试验中不同组间所体现出的痛觉延迟的差异取决于水凝胶降解时间。水凝胶较长的降解时间似乎提供了一个药物释放曲线以及更长的局部麻醉持续时间。然而，给予PLGA-PEG-PLGA/BFB治疗组与对照组BUP·HCl相比运动和感觉阻滞方面均未体现出明显的统计学差异。

比较图1和图2，运动机能比痛觉功能更快恢复，这与之前的研究相符合[6]。尽管所有神经纤维均受局部麻醉剂的作用，神经轴突的痛觉传递在较低的局麻药浓度下即可受到影响。根据临床观察及现有的一些研究显示，轴突的直径和大小仍然是影响传导速度的重要因素[7]。传导速度较慢的、细小的感觉神经轴突(A-δ有髓和C-无髓鞘的纤维)比快传导的，粗大的运动神经轴突(A-α有髓纤维)对于局部麻醉药显示出的更强的敏感性。本研究中描述的控释水凝胶配方可能通过药物的缓慢低浓度释放,延迟痛觉恢复[6]。

PAla-PEG-PAla和PLGA-PEG-PLGA均为PEG为基链的三嵌段聚合物，均已经通过美国FDA(食品及药物管理局)药理应用程序[8]。PAla-PEG-PAla合成同源聚-氨基酸复合物,这是类似于自然产生的蛋白质。而通常认为水凝胶PluronicF127的成胶过程是从凝胶溶液的单聚体平衡状态向胶束形成的平衡状态，胶束中存在大量游离水,导致PluronicF127仅体内存留很短的时间。即PluronicF127凝胶降解并通过表面侵蚀，另外2个水凝胶通过上述机制降解[7]。在我们的研究中使用所有的水凝胶均显示了良好的持久性、强度以及一定的黏度，这些属性使局部麻醉剂的整合得以实施并已经证明能够进一步延长释放期。因此，药物可能在胶束形成过程中均匀包裹于可溶性聚合物，从而可以控制药物从凝胶聚合物中释放的模式[9]。

在组织学检查过程中，PAla-PEG-PAla/BFB组可以观察到明显的局部充血和以及广泛的胶原增生。炎症反应的严重程度似乎与凝胶在体内的存留时间成正比。PLGA-PEG-PLGA在体内的存留时间远超过其对于神经阻滞效果的延长，局部组织的炎症反应使其并非局部麻醉药载体最佳选择。具有较短体内降解时间的水凝胶能够更好的兼顾药效作用时间延长与局部组织炎症反应的最小化。即选择体内降解时间与药物药效时间相接近生物材料载体能够最大程度的提高疗效,减少副作用。