IRF4 通过JAK/STAT 信号通路调控糖尿病肾病炎症进展

邱月 董兰 赵升 秦曙光 何凤

糖尿病肾病（DN）是糖尿病全身性微血管病变常见的并发症之一，其患病率占糖尿病患者的30%～40%，为我国终末期肾病（ESRD）的主要病因，已成为我国慢性疾病的防治重点，其具体的疾病机制也是目前的研究热点。有研究表明，代谢紊乱、血流动力学异常、氧化应激及炎症反应等多种病理过程在DN 的发病过程中发挥着重要作用。然而DN 的具体发病机制尚未完全阐明，新的分子诊断及治疗靶点亟待探索。基因表达综合（GEO）数据库是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）创建并维护的基因表达数据库，收录了大量的高通量基因表达数据。随着生物信息学的发展，对海量数据的挖掘和分析，可深入探索疾病进程中的分子变化和功能联系。本研究拟通过生物信息学方法，筛选DN 中差异表达基因（DEG）并分析相关通路和功能，寻找DN 发展过程中的重要分子并验证其表达，为进一步阐明其发病机制以及寻找靶向分子治疗提供新思路和新靶点。

材料与方法

一、标本来源

从2019 年10 月至2021 年10 月广州市第一人民医院的病理活组织检查 （活检）标本中收集6 例DN 肾组织（DN 组）以及6 例肾肿瘤切除术后癌旁正常组织（NC 组）。DN 组标本来源患者年龄（57.5±2.0）岁、BMI（25.4±1.0）kg/m，诊断符合 《糖尿病肾脏疾病临床诊疗中国指南》 （2021版）。NC 组标本来源患者年龄（55.3±1.9）岁、BMI（24.6±0.9）kg/m。本研究经广州市第一人民医院伦理委员会批准（批件号：K2020-014-01），所有入组患者均已签署知情同意书。活组织离体后，均立即放入液氮，后转入-80 ℃冰箱保存备用。

二、生物信息学分析

使用GEO 数据库中的RNA 测序图谱GSE142025进行基因表达分析，其中包含对照组9 例与进展期DN（aDN 组）21 例。应用基于R 语言4.0.3 版的limma 包对基因表达矩阵进行差异表达分析，可视化NC 组与aDN 组之间的DEG，以差异倍数（FC）取log的绝对值（|logFC|）＞ 1 且调整后P ＜0.05 为DEG 的筛选标准，其中|logFC| ＞ 2 且调整后P ＜ 0.01 为明显上调或下调。基因集富集分析（GSEA）是用来评估一个预先定义基因集中的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势，从而判断其对疾病的作用。采用GSEA 以归一化富集得分（NES）绝对值＞1、P ＜ 0.05、错误发现率（FDR） ＜ 0.25 为筛选条件，利用R 语言进行DEG功能富集。京都基因和基因组百科全书（KEGG）是一个信号通路数据库，可对参与疾病发病机制中重要的信号通路进行注释。使用String （https://cn.string-db.org/）和Cytoscape 3.8.0 可视化中枢（hub）基因之间的蛋白质相互作用（PPI）网络。

三、定量逆转录 PCR（RT-qPCR）验证DEG mRNA 表达

使用TRIzol 试剂（Thermo，美国）提取2 组标本的总RNA，经NanoDrop 检测纯度后将RNA逆转录为模板DNA，随后使用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 试 剂 盒 进 行RT-qPCR 检 测DEG mRNA 表达，每组样品设3 个复孔，2法计算荧光强度阈值（Ct 值），以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，检测样品目的基因相对表达量。

四、过碘酸-希夫（PAS）染色和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）染色验证差异基因蛋白表达

常规石蜡包埋2 组肾组织，4 μm 厚连续切片，切片常规脱蜡、水化后分别采用PAS 染色和SP 染色。PAS 染色为先取过碘酸溶液氧化，样品滴加希夫试剂染色后去除染色液，再用苏木素染色，自来水冲洗后常规脱水、透明、封片，显微镜下拍照。SP 法为3% HO封闭内源性过氧化物酶，采用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，加入正常山羊血清封闭内源性生物素，室温孵育10 min 后甩干，滴加一抗4 ℃孵育过夜，次日取出切片滴加生物素标记的山羊抗兔IgG 及辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下拍照。

五、统计学处理

结 果

一、差异基因表达

通过R 语言分析和筛选GSE14202 中的DEG，得到1213 个DEG。与对照组相比，aDN 组有684个基因上调、529 个基因下调，见图1A。明显上调或下调共50 个DEG，见图1B。

图1 对照组与aDN 组间差异表达的DEG

二、GSEA 功能富集

使用R 语言分析对照组与aDN 组之间的通路富集，其中酪氨酸激酶/信号转导及转录激活因子（JAK/STAT）信号通路、趋化因子信号通路、Fcγ受体介导的巨噬细胞吞噬作用信号通路、白细胞跨内皮迁移和T 细胞受体信号通路明显激活，见图2。明显上调的KEGG 富集通路多与炎症分子及免疫反应过程相关，提示IFN 调节因子4 （IRF4）等明显上调基因可能通过炎症相关通路参与DN 的发生发展。

图2 aDN 组中上调的GSEA 功能富集通路

三、PPI 构建及hub 基因表达验证

将筛选所得的DEG 数据集导入String 网址进行分析，并用Cytoscape 软件可视化得到PPI 网络。PPI 网络中红色为上调基因，蓝色为下调基因，可见IRF4、信号淋巴细胞活化分子6（SLAMF6）、趋化因子受体4（CCR4）和IL-2 受体α 亚基（IL-2RA）作为hub 基因表达上调，见图3A。随后使用RT-qPCR 检测hub 基因在NC 组和DN 组肾组织中的mRNA 相对表达量，结果显示DN 组肾组织中IRF4（t = 25.46，P ＜ 0.001）、SLAMF6（t = 15.31，P ＜ 0.001） 和IL-2RA（t = 19.86，P ＜ 0.001）mRNA 均高于NC 组肾组织，见图3B。PAS 及SP染色检测目的蛋白相对表达量，得到与RT-qPCR一致的结果，见图3C。

图3 hub 基因的筛选及其在DN 肾组织中的mRNA 和蛋白表达

讨 论

DN 是糖尿病严重的微血管并发症，30%～40%的糖尿病患者伴肾损伤。DN 是老年人慢性肾脏病的主要病因，近年在我国发病率急剧上升，已成为ESRD 的第二大病因。研究表明，多条信号通路与 DN 的发病机制有关，包括晚期糖基化终末产物（AGE）的形成、炎症反应、氧化应激、内质网应激和自噬。本研究通过生物信息学的方法，筛选并分析aDN 组和对照组之间的DEG。在筛选出的1213 个DEG 中，与对照组相比，aDN 组684个基因上调、529 个基因下调。KEGG 通路富集分析显示，JAK/STAT信号通路、趋化因子信号通路、Fcγ 受体介导的巨噬细胞吞噬作用信号通路、白细胞跨内皮迁移和T 细胞受体信号通路等炎症相关通路激活，与既往报道一致，炎症反应、细胞因子及趋化因子异常表达在DN 的发生发展中发挥着重要的作用。

JAK/STAT 信号通路主要由JAK 相关受体、JAK 和转录因子三部分组成，在机体中发挥信号转导和基因转录活化子蛋白的双重作用，介导多种细胞因子和生长因子的胞内信号转导过程，并且活化相应靶基因，进而产生生物学效应。在DN中，高血糖、血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）、AGE、活性氧、生长因子、细胞因子和其他上游信号均可激活JAK/STAT 信号通路。Yu 等发现AGE的累积可上调JAK2/STAT3 信号通路，促进炎症反应和足细胞凋亡，诱导DN 的发生。此外，研究表明高血糖状态可以通过Ang Ⅱ增加及活性氧诱导活化JAK2/STAT3 信号通路，使肾小球系膜细胞增殖，进而促进TGF-β 分泌，增加细胞外基质生成，引起肾脏损伤。Ortiz-Muñoz 等向DN 大鼠模型肾内注射质粒和腺病毒载体，局部过表达细胞因子信号抑制物1（SOCS1）及SOCS3 蛋白负性调控JAK/STAT 信号通路活化，可明显减轻DN 大鼠肾脏的炎症和纤维化。随后，Hu 等研究发现，过表达趋化因子C1q/TNF 相关蛋白3 可通过下调JAK2/STAT3 信号通路抑制系膜细胞增殖和活性氧水平，从而减轻DN 的进展。以上结果提示JAK/STAT 信号通路在DN 的炎症过程中发挥着重要的作用。

IRF 是一类通过介导IFN 转录、参与免疫调控作用于多种生物学过程的转录因子。IRF4 为IRF 家族中的一员，其限制表达于免疫细胞，在T 淋巴细胞和B 淋巴细胞的成熟及调节性T 淋巴细胞功能发挥中是必需的。IRF4 既可作为转录激活因子也可作为抑制因子，这取决于它与不同转录因子或特定启动子上的 DNA 结合域的相互作用。IRF4 参与多种炎症性疾病的病理过程，在炎症性肠病中，IRF4 可以促进IL-6 的产生，而IL-6在T 淋巴细胞中诱导STAT3 的表达促进细胞凋亡继而引起肠道炎症。同时，IRF4 也与多种肾脏疾病的发展关系密切，在慢性肾病小鼠模型中，IRF4 通过促进M2 型巨噬细胞的极化、限制1 型辅助性T 淋巴细胞活化和细胞因子表达，限制缺血性肾损伤后的慢性肾脏病进展和肾纤维化。而一项原发性膜性肾病的研究中则发现肾足细胞中NF-κB 的异常激活和IRF4 的表达同步上调。此外，据报道显示，过表达miR-15b 可特异性下调IRF4 以抑制滤泡辅助T 淋巴细胞的增殖和成熟来缓解急性肾损伤，从而改善肾移植术后急性肾损伤的发生。最近的研究表明，IRF4 缺乏可减少叶酸所诱导的急性肾损伤后的炎症和肾纤维化。在IL-21 诱导的STAT3 和 IRF4 结合位点的全基因组 ChIP-Seq 结果中显示，超过70%的STAT3 结合区域与IRF4 共定位，提示STAT3 与IRF4 存在广泛的协同作用。本研究显示，IRF4 作为hub 基因在DN 组织中表达明显上调，hub 基因功能富集多聚焦于炎症及免疫相关通路，提示IRF4 可能作为DN 发病的潜在分子，通过JAK/STAT 信号通路在炎症过程及免疫反应中发挥作用，对其深入研究可为DN 的临床策略提供新的治疗靶点。

本研究利用生物信息学筛选并分析aDN 组和对照组之间的DEG 并进行功能富集，发现IRF4作为hub 基因在DN 中表达上调，RT-qPCR 及SP染色验证其在DN 肾组织中明显上调，结合生物信息分析结果提示其可能通过JAK/STAT 信号通路参与DN 的炎症过程及免疫反应，但具体的作用机制仍需大量实验验证，其为进一步阐明DN 发病机制提供新的潜在的分子机制，为DN 的治疗提供新的靶点和思路。