玉米耐旱相关性状Meta-QTL及候选基因表达分析

郭长顺， 李晓辉， 张春宵， 崔海燕， 金峰学*， 具红光

(1.延边大学 农学院，吉林 延吉 133200；2.吉林省农业科学院 玉米研究所，吉林 公主岭 130033；3.山东省农业科学院 玉米研究所，济南 250100)

在所有影响玉米生产的非生物胁迫中，干旱是最为严重且最具破坏性的因素之一。随着分子标记技术的发展，可以对干旱胁迫下的玉米产量和农艺-生理性状的 QTL进行遗传剖析, 为分子标记辅助改良奠定了基础。迄今为止，前人定位了大量玉米耐旱相关QTL[1-20]，然而，这些研究结果采用的遗传群体材料、分子标记类型以及统计方法大不相同，造成遗传图谱差异较大，定位到的QTL置信区间过大等问题，无法保证QTL的真实性。

元分析作为一种新兴的数据统计分析方法可以对不同研究数据进行再次统计和分析，且可以对数据进行全面检验[21]。采用元分析方法，在整合不同研究背景QTL的基础上，建立数学模型，优化QTL置信区间，提高QTL准确性和有效性。粟文娟等[22]收集了360个玉米耐旱相关QTL，采用元分析和overview方法获得了79个Meta-QTL，并在43个MQTL区间内检测到抗旱相关基因。Chen等[23]收集了999个玉米产量性状相关QTL信息，获得了76个MQTL区域。Zhao等[24]收集玉米株高、ASI等7中农艺性状共637个玉米耐旱相关QTL信息，筛选出36个MQTL，并在MQTL区间内预测了39个候选基因。

该研究收集整理了正常水分条件下玉米耐旱相关QTL信息，利用Biomercator 4.2软件将不同作图群体的QTL映射到IBM2 2008 Neighbors遗传图谱上，通过元分析方法获得玉米耐旱相关Meta-QTL，结合生物信息学方法，在玉米B73基因数据库中寻找与水稻同源的玉米耐旱候选基因，为挖掘玉米耐旱候选基因和进行分子标记辅助育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 玉米耐旱相关QTL信息收集

通过MaizeGDB、中国知网、NCBI等网站收集和整理了20篇文献发表的在正常水分条件下定位到的玉米耐旱相关性状QTL信息，包括QTL名称、QTL性状、染色体位置、LOD值、贡献率、置信区间、群体类型、作图群体大小以及遗传图谱等。

1.2 玉米耐旱相关QTL信息整合

在QTL定位试验中，QTL的置信区间和表型贡献率(R2)为2个重要参数。当某个QTL的置信区间未给出时，可以根据Darvasi和Soller[25]的公式推断出其95%的置信区间。

C.I.= 530/ (N×R2);

(1)

C.I.= 163/ (N×R2);

(2)

式中,CI(confidence interval)指QTL置信区间，N代表作图群体，R2代表该QTL表型贡献率。公式(1)适用于F2作图群体和回交作图群体，公式(2)适用于重组自交系作图群体。

应用Biomercator 4.2软件对收集的玉米耐旱相关性状QTL进行映射，利用齐序函数计算共有标记区间，将原始QTL置信区间的两端分子标记和QTL的最佳位置按比例标注在IBM 2 2008 Neighbors参考图谱上[26]。为提高映射的准确性，舍弃存在争议的标记和不能映射在参考图谱QTL的信息。

1.3 玉米耐旱相关QTL的元分析

利用Biomercator 4.2软件中的Meta-analysis程序对整合后的IBM2 2008 Neighbor遗传图谱进行元分析。将同一染色体同一位点附近多个独立实验QTL计算出1个一致性QTL，其过程包括1-、2-、3-、4-、N-QTL等5个模型，并按照最大似然函数比，通过高斯定理给出 QTL 在染色体上最可能排列的位置和置信区间，其中，AIC最小值给出的模型为最优QTL模型，即Meta-QTL[27]。筛选条件为原始QTL的LOD值≥3、R2值≥5。

1.4 基于基因比较定位的玉米耐旱候选基因挖掘

从Gramene网站(https://www.gramene.org/)收集克隆的水稻耐旱基因，在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载基因核苷酸序列，并利用NCBI在线软件Blastn比较水稻耐旱基因核苷酸序列与玉米B73基因组数据库中核苷酸序列的同源性。对比条件为E-value值小于1E-20，核苷酸序列匹配度大于80%确定同源。挖掘与水稻耐旱相关基因同源的玉米耐旱候选基因。

1.5 玉米耐旱候选基因在不同组织中的表达模式

利用NCBI网站的GEO Data Sets功能查询GSE71723转录组表达谱数据，下载该研究找到的玉米耐旱候选基因在根、茎、叶、穗4个不同组织的水分条件下和干旱胁迫条件下的转录组数据。利用imageGP网站(www.bioinformatics.com.cn)对玉米耐旱候选基因的组织表达数据进行对数转换和可视化。

2 结果与分析

2.1 玉米抗旱相关QTL信息的收集与映射

共收集国内外发表的20篇玉米耐旱相关QTL定位文章，涉及17个作图群体。耐旱相关15个性状，分别为株高、穗位高、根长、根重、根数、散粉期、吐丝期、ASI、穗长、穗粗、穗行数、行粒数、百粒重、结实率、产量，映射在IBM2 2008 Neighbors图谱的211个QTL在10条染色体上呈不均匀分布，其中，第2和第4两条染色体QTL数目最多，第5和第8条染色体QTL数目最少(图1)。玉米耐旱相关QTL中共有68.24%QTL表现为R2≤10%，说明玉米耐旱性为多个微效基因所控制(图2)。

图1 QTL在染色体上的分布情况 图2 实验所包含的性状中由单个QTL解释的方差

2.2 玉米耐旱相关性状QTL元分析

利用Biomercator 4.2软件中的元分析程序对映射到IBM2 2008 Neighbors参考图谱上的211个QTL进行元分析，得到39个MQTL，共包含了3 348个基因(表1)。39个MQTL在玉米10条染色体上均有分布，依次为6、5、2、2、3、5、4、3、5和4个(图3)，其置信区间均有不同程度缩小(表1)，如1号染色体MQTL2由7个QTL整合得到，原平均图距17.21 cM，整合后MQTL区间为8.5 cM；4号染色体MQTL14由7个QTL整合得到，原平均图距为21.26 cM，整合后MQTL图距为4 cM。此外，还发现与多个耐旱性状相关的MQTL，例如1号染色体MQTL4与根长、百粒重相关；4号染色体MQTL15与茎粗、单株穗数、穗位高、散粉期相关；上述MQTL区段可能存在控制玉米耐旱性状的“一因多效”QTL。

表1 正常条件下MQTL相关信息

续表1 正常条件下MQTL相关信息

图3 MQTL在染色体上的位置

2.3 基于基因比较定位的玉米耐旱候选基因挖掘

为了鉴定与MQTL区域耐旱相关的候选基因，从Gramene网站(https://www.gramene.org/)收集了9个功能特征与耐旱相关的水稻基因，利用NCBI网站在线软件Blastn比较水稻耐旱基因核苷酸序列与玉米B73基因组数据库中核苷酸序列的同源性。经同源比对发现，3个水稻耐旱基因(OsSKIPa、ZFP185、OsMFT1)同源的玉米候选基因未在MQTL区域，其余6个同源的玉米候选基因均在MQTL区域内，分别位于MQTL7、MQTL21、MQTL22、MQTL27、MQTL32和MQTL36区间内(表2)。

表2 玉米耐旱候选基因

2.4 玉米耐旱候选基因在不同组织中的表达模式

为探究耐旱候选基因在玉米中的组织特异性表达模式，对6个玉米耐旱候选基因正常水分条件下和干旱处理条件下的表达数据进行分析，研究了玉米根、茎、叶和穗4个不同组织的转录水平，发现6个玉米耐旱候选基因在不同组织或器官中的表达模式有明显差异。受干旱胁迫诱导，Zm00001d037112在根、茎、穗中上调表达；Zm00001d045384在叶中下调表达，在茎中上调表达；Zm00001d023294在根、穗、叶中上调表达，在茎中下调表达；Zm00001d019230在茎中下调表达；Zm00001d038453在根中下调表达；Zm00001d034601在穗、叶中上调表达(图4)。

图4 玉米耐旱候选基因表达分析

3 讨论与结论

玉米耐旱性状是复杂的数量性状，受众多微效QTL控制。由于不同研究定位所采用的群体类型、遗传背景、作图方法的不同，定位结果往往不一致。因此，需要整合来自不同研究的QTL数据，利用Meta分析确定MQTL区域。该研究共收集了211个玉米抗旱相关QTL信息，最终得到39个与玉米耐旱相关的一致性QTL(Meta-QTL)区域。在所发掘的MQTL置信区间与原始QTL置信区间相比均有不同程度的缩小，在很大程度上提高了MQTL挖掘的可靠程度。与粟文娟等[22]研究结果相比较，共得到4个高度重叠的MQTL区域，分别为MQTL1、MQTL5、MQTL10和MQTL60以及2个MQTL相邻区域，分别为MQTL9和MQTL13。

该研究通过与水稻耐旱相关基因同源比对，最终在6个MQTL区域得到6个玉米耐旱候选基因。其中，OsSAP1通过影响一些相同的内源基因表达来增强植株对水胁迫的耐受性，阻止转基因植株在逆境中的产量损失。OsNAC5在干旱胁迫下会上调水稻中GLP，PDX，MERI5，O-甲基转移酶的活性，促使水稻根、茎增粗，从而提高水稻抗旱能力和水稻产量。OsNAC10在根中特异表达，增大了根系，增强了转基因植株的耐旱性。OsAE115在干旱条件下参与油菜素内脂信号和生长素信号，正向调节细胞分裂和细胞伸长，从而影响籽粒大小和产量。GUDK通过磷酸化和激活OsAP37来介导干旱胁迫信号的传导，激活胁迫相关基因提高抗旱性。ALM1编码一个定位于叶绿体的超氧化物歧化酶，主要通过清除植物体内过量的活性氧而维持植物的正常发育。同时还发现并非所有玉米同源基因与MQTL区域重叠，例如与OsSKIPa[34]同源的玉米基因Zm00001d028814临近MQTL3区域；与OsMFT1[35]同源的玉米基因位于上述区域以外的染色体其他位置。其原因可能是玉米耐旱QTL定位所用到遗传群体大多为初级群体，原始QTL真实性较低，以及Biomercator 4.2软件在进行一致性图谱映射时存在QTL数据丢失等问题，导致最终结果存在偏差。