一例山羊传染性胸膜肺炎混合感染大肠杆菌的诊治报告

马宇毅，李鹏举，潘 艳

（1.广西兽医研究所，南宁 530001；2.广西大学动物科学技术学院，南宁 530004；3.广西农业职业技术大学，南宁 530007）

随着乡村振兴战略的大力推进，广西壮族自治区利用得天独厚的资源优势大力发展山羊产业，同时养殖规模的扩大，山羊疫病日益复杂，尤其以呼吸道疾病最为显著，病原以绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、肺炎克雷伯氏菌、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌等为主。传染性胸膜肺炎传播速度快、难以净化，容易与其他疾病发生混合感染，增加了治疗的难度，而不合理的用药又容易造成病菌的耐药性。因此，开展病原的快速分离与鉴定，同时通过药敏试验筛选敏感药物，可以有效地减少病菌耐药性的产生，降低发病率，减少用药成本，并达到有效控制疫病的目的。

2021 年3 月，广西壮族自治区崇左市某山羊规模化养殖场发现大量羊只存在气喘、咳嗽、打喷嚏、流鼻涕等症状，部分山羊还伴有腹泻、拉稀，发病率达75%、死亡率为2%。剖检发现病变以浆液性和纤维蛋白性肺炎以及胸膜炎为主，对内脏进行病原菌分离培养及PCR 鉴定，结果显示主要病原为绵羊肺炎支原体和大肠杆菌，随即选择敏感药物进行针对性治疗，同时加强生产管理与生物安全防控，有效地降低了养殖场山羊发病率，提高养殖效益。现将该病例的诊治情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2021 年3 月，广西壮族自治区崇左市某种羊养殖场出现大量羊群伴有长时间的气喘、咳嗽、打喷嚏、流鼻涕、拉稀等症状，取症状明显的山羊解剖，将内脏装于干净的塑料袋内，置于放有冰块泡沫箱中送至实验室检测。

1.1.2 试剂 病毒DNA/RNA 提取试剂盒、100 bp Ladder、2×EsTaqMasterMix（Dye）、ddH2O 均购自北京康为世纪生物科技有限公司；革兰氏染色试剂盒、伊红美蓝平板购自北京陆桥技术股份有限公司；用于绵羊肺炎支原体（MO2）、丝状支原体山羊亚种（MMMLC2）、多杀性巴氏杆菌A 型（PMA）与多杀巴氏杆菌D 型（PMD）PCR 扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 PCR 扩增引物

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 用酒精棉球对采集的各内脏取样表层进行消毒灭菌，选取病变较为明显的部位剪开，用无菌接种环蘸取病变组织部位划线于伊红美蓝平板上，培养24 h。

1.2.2 细菌的革兰氏染色镜检 用无菌接种环刮取单个菌落，涂布于滴加去离子水的载玻片上，采用革兰氏染色法处理后进行观察。

1.2.3 病料DNA/RNA 的提取 将肺脏的病变部位剪取小部分，置于无菌研钵中，加入1 mL 的生理盐水进行研磨，直至组织样品破碎，然后将研磨好的组织样品装入2 mL EP 管中，将装有样品的EP 管反复冻融3 次，使病菌细胞破裂，便于细菌DNA/RNA的提取。参考GB/T19915.4—2000 标准方法，对样品进行PCR 鉴定。将EP 管中反复冻融的样品在12 000 r/min 离心5 min，用移液枪吸取上层液体置于1.5 mL EP 管，加入蛋白酶K 后提取病料样品的DNA/RNA，置于-20 ℃备用。

1.2.4 PCR 鉴定 参考GB/T19915.4—2000 标准方法，进行 PCR 鉴定［2］。PCR 反应体系为：2×EsTaqMaster Mix（Dye）13 μL；上、下游引物各 1 μL；样品3 μL；补充 ddH2O 至 25 μL。PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（退火温度参考各引物的退火温度见表1），72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 min 延伸4 min；4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，凝胶成像系统观察分析。

1.2.5 药敏试验 用无菌接种环刮取单个菌落溶解于灭菌生理盐水中，制备成0.5 麦氏单位的菌悬液，然后用无菌棉拭子蘸取菌悬液均匀涂布于MH 琼脂平板上，将药敏纸片贴在平板内，37 ℃培养24 h 后，测量抑菌环的直径并记录。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离结果

在伊红美蓝琼脂培养基上观察到深紫黑色、光滑，带有金属光泽的圆形菌落［3］。同时，革兰氏染色镜检发现呈两端顿圆、粉红色杆状的形态，结合临床症状综合认为是致病性大肠杆菌。

2.2 PCR 鉴定结果

对PCR 扩增产物进行凝胶电泳检测，被检测样品中只有绵羊肺炎支原体在250～500 bp 之间出现目的条带，其他样品均无条带，该羊只感染的病原菌是绵羊肺炎支原体［4］。

2.3 药敏试验结果

选择24 种药敏试纸片进行致病性大肠杆菌药敏试验，结果如表2 所示。分离的致病性大肠杆菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、罗红霉素、林可霉素、克拉霉素、克林霉素、链霉素、利福平、阿齐霉素、万古霉素不敏感；对头孢他唑、阿米卡星、强力霉素、四环素中度敏感；而对头孢氨苄、头孢西丁、头孢曲松钠、氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、卡那霉素、诺氟沙星、复方新诺明高度敏感。

表2 分离菌株药敏试验结果

2.4 治疗

隔离患病羊群是关键，以降低疾病的蔓延，从而便于精准化用药治疗。治疗措施如下：①酒石酸泰乐菌素注射液2～10 mg/kg 体重，皮下或肌肉注射，每天2 次，连用3 d；②氧氟沙星注射液2.5 mg/kg，肌肉注射，每天 2 次，连用 3 d［5］。

2.5 预防

制定科学免疫程序，加强饲养管理。日常饲养中杜绝羊群采食、饮用混有粪便的饲料与水，在饲料与饮水中加入麻杏石甘散、白头翁、益生菌等中草药及生物制剂，既可以抑制有害菌的生长，又可以预防慢性的呼吸道疾病与消化道疾病。每个季度都要用阿苯达唑、伊维菌素、拟除虫菊酯对羊群容易感染的线虫、球虫、羊螨虫等进行消杀，保证羊群的健康。

3 小结与讨论

通过临床初步诊断及实验室诊断，该山羊规模化养殖场疫病主要由山羊传染性胸膜肺炎混合感染大肠杆菌病引起的，因此对规模养殖场进行疾病快速检测与诊断，可以有效地减少发病率和传染率，提高治疗效果，降低养殖成本及养殖风险性。而使用高敏性抗菌药物，既可以降低病菌的耐药性又可以达到减少抗生素的滥用。规模化养殖还是主要以预防为主，做到早发现、早诊断、早治疗。

通过对广西某山羊规模化养殖基地进行调研，发现圈舍多以高1.2 m 全木式高架床为主，不锈钢自动饮水碗为主。但广西常年高温高湿，山羊又生性好斗，木条作为圈舍的基床底架很容易腐朽、歪斜、脱落、断裂，容易造成山羊的卡脚，羊群的踩伤、甚至踩死。而不锈钢饮水碗又容易被羊群撞坏甚至将粪便拉入饮水碗内，进而造成羊群因为长时间饮用不干净的水源而产生疾病。在哺乳期圈舍中由于成年母羊与未断奶小羊在共同的圈舍中，小羊穿梭于食草与圈舍之间，食草中常常混有小羊的粪便，也会影响羊群的健康。因此，应该把圈舍合理规划布局作为重点，才能更好地进行养殖。而2 cm×2 cm 的钢丝网床成为首选的目标，结合钢筋混凝土加固圈舍的建设，在混凝土墙体上设置凹槽，将不锈钢饮水碗放置凹槽内，防止羊群撞坏、拉入粪便进去，对哺乳圈舍中的食槽做特殊处理，将食槽抬高至60 cm 的位置，防止小羊进入食槽。在哺乳圈舍内设置补饲栏，在哺乳期后1 个月内进行母乳+补饲的模式，提前使小羊适应饲养情况，更有利于母羊恢复体况，进行下批次的繁殖。