miRNA-185-5p通过靶向YWHAZ对人非小细胞肺癌细胞A549恶性生物学行为的影响*

李奇炯，颜伏归

(1.浙江大学附属第二医院呼吸与危重医学科，杭州 310000；2.浙江大学临床医学系，杭州 310058)

肺癌是世界范围内发病率和病死率最高的肿瘤，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌患者的80%～85%[1-2]。尽管目前手术治疗和靶向疗法取得了极大的进展，然而晚期肺癌患者生存率仍然较低，且超过一半的患者在确诊时已经出现远处转移，因此，有必要识别NSCLC患者新生标志物和潜在的治疗靶点[3-4]。 微RNA (miRNA)是为17～25个核苷酸的小型非编码RNA，在肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学活动中发挥着重要作用[5]。有研究发现，miRNA-185-5p在肝癌细胞和肝癌组织中低表达，而过表达miRNA-185-5p能明显抑制肝癌细胞的迁移和侵袭[6]。但miRNA-185-5p在NSCLC中的表达及其作用尚不清晰。本研究旨在识别miRNA-185-5p在NSCLC中的表达，并探讨miRNA-185-5p对NSCLC细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化的影响及作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

(1)临床标本：2018年7月至2019年9月收集40例NSCLC患者癌组织和癌旁组织标本。其中男27例，女13例，年龄39～72岁。所有组织标本在获得后立即置于液氮保存。(2)细胞系及试剂：人NSCLC细胞株HCC827、NCL-H358、NCL-H1299、A549、人正常肺上皮细胞BEAS-2B和RPMI-1640培养基均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，胎牛血清、miRNA-NC、miRNA-185-5p模拟物、miRNA-185-5p抑制剂、酪氨酸3/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(YWHAZ)过表达质粒及PCR引物均购于上海吉玛生物工程有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒和RevertAid RT反转录试剂盒购于美国Thermofish科技有限公司；CCK-8试剂盒和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测实验试剂盒购于美国Promega公司；兔多抗E-cadherin、兔单抗Vimentin、兔多抗YWHAZ和山羊抗兔IgG H&L抗体均购于武汉爱博泰克生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与转染

将NSCLC细胞株HCC827、NCL-H358、NCL-H1299、A549和人正常肺上皮细胞BEAS-2B接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中常规培养。取对数生长期的A549细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板上，根据LipofectamineTM2000说明书进行操作，分别将 miRNA-NC、miRNA-185-5p模拟物、miRNA-185-5p抑制剂、miRNA-185-5p 模拟物和pcDNA3.0-YWHAZ共转染入细胞，设为miRNA-NC组、miRNA-185-5p模拟物组、miRNA-185-5p抑制剂组和miRNA-185-5p模拟物+pcDNA3.0-YWHAZ组。

1.2.2RT-qPCR检测miRNA-185-5p和YWHAZ的表达

使用TRIzol试剂提取NSCLC癌组织和细胞总RNA，检测浓度后，反转录为cDNA。miRNA-185-5p引物：5′-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUG A-3′；YWHAZ引物。上游：5′-AAA TGA AAG GAG ACT ACT ACC GCT A-3′，下游：5′-AGA CCC AAT CTG ATA GGA TGT GTT G-3′；GAPDH引物。上游：5′-GTC GGA GTC AAC GGA TTT G-3′，下游：5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′；U6引物。上游：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。扩增条件：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸25 s，扩增40个循环。采用2-ΔΔCt的方法处理数据。

1.2.3Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

取各组对数生长期的A549细胞，以3×104个/孔的密度接种于预涂基质胶的Transwell小室上室，每个上室滴加150 μL细胞悬液和无血清培养基，在小室下室加入500 μL含10%胎牛血清的培养基，24 h后，将下室细胞用4%多聚甲醛固定15 min，用结晶紫染液染色。在100倍光学显微镜下观察，每孔随机选取3个视野，计数并取平均数。

1.2.4CCK-8检测细胞增殖能力

取对数生长期的各组A549细胞，以5×103个/孔的密度接种于96孔细胞板上，每孔150 μL细胞悬液。分别于接种后24、48、72 h加入10 μL CCK-8试剂，培养箱内培养1 h后，酶标仪检测每孔细胞在450 nm处的吸光度(A)值。

1.2.5TUNEL检测细胞凋亡

用4%多聚甲醛于室温下固定40 min，PBS洗涤3次，用含0.3% Triton X-100的PBS重悬细胞，5 min后向每个样品加50 μL TUNEL检测液，在37 ℃下避光孵育60 min，孵育结束后，PBS洗涤3次，用DAPI染色后在荧光显微镜下观察计数细胞，并计算细胞凋亡率。细胞凋亡率(%)=(凋亡阳性细胞数/细胞总数)×100%。

1.2.6Western blot实验检测目标蛋白表达

收集转染后各组A549细胞，提取蛋白样品。取20 μL总蛋白上样于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上电泳分离蛋白，转膜。室温下，采用5%脱脂牛奶封闭1 h。洗膜后，加入一抗在4 ℃下孵育过夜，洗膜，加入二抗在室温下孵育1.5 h。洗膜后，ECL显影，采用图像分析软件ImageJ对Western blot实验所得结果图像进行灰度分析。

1.2.7生物学信息技术预测和双荧光素酶报告基因实验验证

使用StarBase在线数据库预测miRNA-185-5p的靶基因。取对数生长期的A549细胞，随机分为4组：野生型+miRNA-185-5p组(共转染野生型载体质粒和miRNA-185-5p)、野生型+miRNA-NC组(共转染野生型载体质粒和miRNA-NC)、突变型+miRNA-185-5p组(共转染突变型载体质粒和miRNA-185-5p模拟物)、突变型+miRNA-NC组(共转染突变型载体质粒和miRNA-NC)。检测各组A549细胞萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 miRNA-185-5p在NSCLC组织中的表达

通过分析GSE152702数据集发现，miRNA-185-5p在NSCLC患者血浆中的表达水平明显低于健康者。RT-qPCR实验结果显示，与癌旁组织比较，NSCLC癌组织中miRNA-185-5p表达水平明显降低(P<0.01)，见图1A。与正常人肺上皮细胞BEAS-2B比较，NSCLC各细胞株miRNA-185-5p表达水平明显降低，其中A5495细胞miRNA-185-5p表达水平最低，见图1B。故选择A5495细胞进行后续实验。

A:NSCLC癌组织与癌旁组织miRNA-185-5p表达水平比较;B:各组细胞株miRNA-185-5p表达水平比较;1：BEAS-2B；2：HCC827；3：NCL-H358；4：NCL-H1299；5：A5495；a：P<0.01，与癌旁组织比较；b：P<0.05，c:P<0.01,与BEAS-2B比较。

2.2 各组A549细胞miRNA-185-5p表达水平及细胞增殖和凋亡率比较

RT-qPCR实验结果显示，与miRNA-NC组比较，miRNA-185-5p模拟物组miRNA-185-5p表达水平明显升高(P<0.05)，miRNA-185-5p抑制剂组miRNA-185-5p表达水平明显降低(P<0.05)，见图2A。CCK-8实验检测各组A549细胞的增殖能力，第48小时开始，与miRNA-NC组比较，miRNA-185-5p模拟物组增殖能力明显降低(P<0.05)，miRNA-185-5p抑制剂组增殖能力明显升高(P<0.05)，见图2B。TUNEL实验结果显示，与miRNA-NC组比较，miRNA-185-5p模拟物组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，miRNA-185-5p抑制剂组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)，见图2C、D。

A:RT-qPCR检测;B:CCK-8检测;C、D:TUNEL检测细胞凋亡率及显微镜观察(×100);1：miRNA-NC组；2：miRNA-185-5p模拟物组；3：miRNA-185-5p抑制剂组；a：P<0.05，b：P<0.01，与miRNA-NC组比较。

2.3 各组A549细胞侵袭和上皮间质转化相关蛋白表达水平比较

与miRNA-NC组相比，miRNA-185-5p模拟物组穿膜细胞数明显降低(P<0.05)，E-cadherin表达水平明显升高(P<0.01)，Vimentin表达水平明显降低(P<0.05)；miRNA-185-5p抑制剂组穿膜细胞数明显升高(P<0.01)，E-cadherin表达水平明显降低(P<0.01)，Vimentin表达水平明显升高(P<0.01)，见图3。

A、B:Transwell检测(×100);C、D:Western blot检测;1：miRNA-NC组；2：miRNA-185-5p模拟物组；3：miRNA-185-5p抑制剂组；a：P<0.05，b：P<0.01，与miRNA-NC组比较。

2.4 StarBase数据库在线预测miRNA-185-5p靶向调控YWHAZ表达水平

通过StarBase数据库对miRNA-185-5p靶基因进行检索，发现有3 740个基因，通过Targetscan数据库检索发现有385个基因，随后通过Human protein Atlas数据库检索与NSCLC不良预后有关的基因，发现有297个基因，将检索出的基因制作韦恩图，见图4A。通过GEPIA数据库分析YWHAZ在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及与预后的相关性，发现YWHAZ在肺腺癌和肺鳞癌中均高表达，且与预后不良有关，见图4B、C。StarBase网站预测分析显示，YWHAZ-3′UTR中部分核苷酸序列能与miRNA-211-5p形成互补配对，见图4D。通过双荧光素酶报告基因实验发现，与miRNA-NC组相比较，miRNA-185-5p模拟物组WT载体的细胞萤光素酶相对活性明显降低(P<0.05)，而MUT荧光素酶相对活性则无明显差异(P>0.05)，见图4E。Western blot实验结果显示，与miRNA-NC组相比较，miRNA-185-5p模拟物组细胞中YWHAZ蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，而miRNA-185-5p抑制剂组细胞中YWHAZ蛋白表达水平明显升高(P<0.01)，见图4F。

A:基因韦恩图;B、C:GEPIA数据库分析;D:StarBase网站预测分析;E:双荧光素酶报告基因检测;F:Wetern blot检测;1：miRNA-NC组；2：miRNA-185-5p模拟物组；3：miRNA-185-5p抑制剂组;a：P<0.01，与miRNA-NC组比较。

2.5 miRNA-NC组、miRNA-185-5p模拟物组及miRNA-185-5p模拟物+pcDNA3.1-YWHAZ组A549细胞侵袭、增殖及上皮间质转化相关蛋白表达水平比较

miRNA-NC组比较，miRNA-185-5p模拟物组48 h后细胞增殖能力明显下降(P<0.05)，细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，侵袭细胞数明显减少(P<0.05)，E-cadherin表达水平明显升高(P<0.05)，Vimentin表达水平明显降低(P<0.05)；与miRNA-185-5p模拟物组比较，miRNA-185-5p模拟物+pcDNA3.1-YWHAZ组48 h后细胞增殖能力明显升高(P<0.05)，细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，侵袭细胞数明显增加(P<0.05)，E-cadherin表达水平明显降低(P<0.05)，Vimentin表达水平明显升高(P<0.05)，见图5。

A:细胞增殖曲线图;B:细胞凋亡检测;C:侵袭细胞检测;D、E:Wetern blot检测;1：miRNA-NC组；2：miRNA-185-5p模拟物组；3：miRNA-185-5p模拟物+pcDNA3.0-YWHAZ组；a：P<0.01，b：P<0.05，与miRNA-NC组比较;c：P<0.05，与miRNA-185-5p模拟物组比较。

3 讨 论

NSCLC是人类最常见的恶性肿瘤，也是肿瘤相关死亡最常见的原因；NSCLC的常规治疗手段包括手术治疗、放疗和化疗[1-2]。然而很多患者确诊时已经为疾病进展期，错过了手术时机；发生远处转移和术后复发的NSCLC患者，预后极差[1-2]。因此，阐明NSCLC发生和发展的分子机制，对于提高NSCLC的诊疗和治疗具有重要意义。

miRNA通过与靶基因3′非翻译区结合，调控靶基因的表达，发挥着抑癌或促癌的作用[7-9]。有研究发现，miRNA-939在NSCLC患者中高表达，抑制miRNA-939能明显降低NSCLC侵袭和上皮间质转化的能力[10]。另有研究发现，miRNA-185-5p在NSCLC中低表达，而上调miRNA-185-5p的表达，会抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭、迁移，并促进细胞凋亡[11]。本研究结果与之类似，发现miRNA-185-5p在NSCLC组织及细胞系中明显下调，进一步通过实验发现，过表达miRNA-158-5p能明显抑制NSCLC细胞侵袭、增殖和上皮间质转化的能力，并促进凋亡，结果显示miRNA-158-5p在NSCLC中发挥着抑癌基因的作用。本研究结果提示，外源性诱导miRNA-158-5p可能是治疗NSCLC的潜在思路。

YWHAZ是许多信号转导通路的中心枢纽蛋白，参与癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的调控[12]。有研究报道显示，YWHAZ在上皮性卵巢癌细胞中呈高表达，敲低YWHA的表达，能明显降低上皮性卵巢癌细胞增殖和侵袭能力[13]。在人骨肉瘤细胞中，通过下调YWHAZ的表达，能抑制人骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型[14]。DENG等[15]研究报道，YWHAZ的表达在NSCLC组织中明显上调，且其高表达与患者的临床分期、淋巴结转移和远处转移有关，提示患者的不良预后；沉默YWHAZ的表达能明显抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。本研究发现，miRNA-158-5p与YWHAZ存在靶向关系，miRNA-158-5p可负向调控YWHAZ的表达，上调YWHAZ可逆转过表达miRNA-211-5p对NSCLC细胞侵袭、增殖的抑制作用和凋亡的促进作用。本研究结果显示，在NSCLC细胞中，miRNA-158-5p与YWHAZ之间存在调控关系。本研究不仅帮助阐明了miRNA-158-5p抑制NSCLC细胞恶性表型的可能分子机制，也助于解释YWHAZ在NSCLC组织中表达紊乱的可能原因。

本研究有一些局限性，(1)在本研究中，miRNA-158-5p在NSCLC组织中的表达水平和患者的预后关系尚不明确。(2)本研究生物信息学分析提示，miRNA-158-5p有多个候选的靶基因，miRNA-158-5p可能通过除YWHAZ之外的其他靶基因调控NSCLC细胞的恶性生物学行为，这些潜在的miRNA-158-5p靶基因还有待后续研究进一步验证。(3)针对miRNA-158-5p的生物学功能，本研究仅设计了细胞实验，在后续工作中，动物实验将有助于进一步明确miRNA-158-5p在NSCLC中的抑癌特性。

综上所述，本研究探索了miRNA-158-5p在NSCLC中的表达和功能，并证实miRNA-158-5p可通过调控YWHAZ抑制NSCLC细胞侵袭、增殖，并促进凋亡。本研究结果显示，miRNA-158-5p/YWHAZ轴在NSCLC发生、发展过程中的意义，为NSCLC的诊断和治疗提供了潜在的标志物和靶点。