84消毒剂对活性污泥降酚效能的影响

杨春钰，李洪欣，相金汛，武井昕，时胜男

(辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081)

0 引 言

面对突如其来的新冠肺炎疫情，全国人民上下一心共同奋战，国内疫情已得到基本控制。在本次抗击疫情的过程中，预防性消毒工作被公众广泛重视。开展预防性消毒可以切断病毒的传播，含氯消毒剂因其能切断病源传播的特性而被广泛应用，尤其是84消毒剂。这些含氯消毒剂不可避免的通过生活污水和工业废水流入污水处理厂，导致污水中余氯含量大幅提高。众所周知，余氯主要包括氯气、次氯酸、次氯酸盐离子以及游离的次氯酸单体，具有改变微生物细胞膜通透性的作用，并能进入微生物细胞质中使蛋白质变性，破坏微生物的酶系统，从而起到抑制微生物生长或杀死微生物的作用[1]。因此，含氯消毒剂的大量使用对活性污泥处理效能是否产生影响成为研究的热点问题。

84消毒剂的主要成分为次氯酸钠。李渭印等以次氯酸钠为消毒剂，考察其对活性污泥降解性能的影响，当次氯酸钠浓度为0.5 mg/L时，对活性污泥的活性基本没有影响，但当次氯酸钠浓度为0.5～3 mg/L时，则会抑制活性污泥对氨氮的降解[2]。陈琳风等探究了高浓度次氯酸钠对活性污泥系统中微生物的影响，结果表明当次氯酸钠浓度为15 mg/L时，能显著杀灭亚硝酸盐氧化菌，进而抑制硝化和反硝化活性，并且胞外聚合物(EPS)总含量降低了15.48%[3]。以上研究表明，一定浓度的84消毒剂会抑制活性污泥的活性，但关于其对活性污泥效能的影响，缺乏系统的研究，同时84消毒剂的浓度阈值未见报道。

本研究以SBR体系为对象，系统考察了不同浓度的84消毒剂对活性污泥处理含酚废水效能的影响，确定浓度阈值，并通过毒理学特性分析及胞外聚合物(EPS)结构与功能分析，揭示了84消毒液的毒性机制。

1 材料与方法

1.1 污泥来源及进水水质

反应器活性污泥(AS)取自大连市春柳河污水处理厂二沉池。本实验废水为人工配制污水，进水水质为：(NH4)2SO42.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，Na2HPO43.3 g/L，苯酚浓度为600 mg/L，水质指标COD理论值为1 563 mg/L。84消毒剂有效氯含量为4%～6%。

1.2 反应体系的构建及运行参数

取6个干净的锥形瓶(250 mL)，分别加入100 mL的泥水混合物以构建批式摇瓶实验，混合液悬浮固体浓度(MLSS)为4.5 g/L，污泥沉降比(SV30)为21%，污泥体积指数(SVI)为46.7 mL/g。根据投加的84消毒剂(有效氯)浓度将摇瓶分别命名为C1体系(0)、C2体系(1 mg/L)、C3体系(2 mg/L)、C4体系(3 mg/L)、C5体系(4 mg/L)和C6体系(5 mg/L)，将各摇瓶置于30 ℃，150 r/min的摇床中进行培养。在反应体系运行24 h内，每隔2 h取样测定苯酚降解效率，在运行到24 h时测定各体系中相关酶活性、ATP、ROS、LDH及EPS含量。

1.3 分析方法

1.3.1 苯酚降解率的测定

使用METASH UV-5800紫外-可见分光光度计(中国，上海)在苯酚特征峰吸收峰269 nm下进行测定。

1.3.2 脱氢酶(DHA)活性的测定

采用TTC-脱氢酶活性法进行测定[4]。

1.3.3 苯酚羟化酶(PHO)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)活性的检测

C23O和PHO活性测定参照文献[5]。

1.3.4 ATP含量的检测

采用ATP含量检测试剂盒，并按照说明书进行ATP含量的检测。

1.3.5 ROS和LDH的检测

采用ROS检测试剂盒检测细胞内ROS的产生。采用LDH检测试剂盒按照说明书检测体系内LDH的释放。

1.3.6 EPS相关测定

蛋白质浓度和多糖浓度分别采用考马斯亮蓝法和蒽酮-浓硫酸法[6]。

1.3.7 3D-EEM表征

荧光光谱仪的扫描条件如下：激发波长(Ex)范围为240～480 nm，发射波长(Em)范围250～580 nm，夹缝均为10 nm，扫描速度为2 400 nm/min。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中苯酚降解效率的影响

各活性污泥体系中苯酚的降解情况如图1所示，C3体系的苯酚降解效率在8 h内达到了100.0%，均高于C1体系(96.2%)、C2体系(98.2%)、C4体系(95.4%)、C5体系(92.6%)和C6体系(88.9%)。从图1中可以看出，在反应运行8 h内，C1、C2和C3的苯酚降解效率随84消毒剂浓度的增大而增大，C4、C5和C6中的苯酚降解效率随84消毒剂浓度的增大而降低。该结果表明低浓度的84消毒剂(小于2 mg/L)对SBR体系中苯酚的降解有促进的作用，而高浓度的84消毒剂(大于2 mg/L)则会抑制活性污泥体系中苯酚的降解。有研究表明强氧化剂能够将苯酚氧化为易被微生物降解的物质，促进微生物对苯酚的降解[7]。

图1 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中苯酚降解率的影响Fig.1 The effects of different concentrations of 84 disinfectanton the degradation rate of phenol in the SBR system

因此，当84消毒剂浓度小于2 mg/L时，会促进苯酚废水的降解，可能归因于84消毒剂将苯酚氧化为易被微生物降解的物质，进而促进苯酚降解效率的提高。当84消毒剂浓度大于2 mg/L时，可能由于其生物毒性大于其促进效果，进而抑制苯酚废水的降解。

2.2 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中DHA活性和ATP含量的影响

TCA循环和氧化磷酸化是生物化学的基本过程，通过这两个过程，微生物可以在有氧的条件下对有机化合物进行代谢分解，所以可以利用DHA活性和ATP含量来表达微生物的生物降解能力[9-10]。如图2(a)所示，以C1体系中DHA的活性为100.0%，C2和C3体系中DHA活性随84消毒剂浓度的增大而增大，而C4、C5和C6体系中DHA活性随84消毒剂浓度的升高而降低，即C3体系最高(108.0%),其次是C2体系(103.4%)、C4体系(99.0%)和C5体系(95.5%)，C6体系中DHA的活性最低(89.0%)。以上结果表明，当84消毒剂浓度小于2 mg/L时，84消毒剂对活性污泥DHA活性具有促进作用，从而提升活性污泥体系中苯酚的降解效率；当84消毒剂浓度大于2 mg/L 时，84消毒剂对活性污泥体系中DHA的活性起抑制作用，导致活性污泥体系中苯酚的降解效率逐渐降低。

如图2(b)所示，各体系中ATP含量的变化与DHA活性的变化趋势一致。以C1体系中的ATP含量为100.0%，C2和C3体系中ATP含量随84消毒剂浓度的升高而升高，而C4、C5和C6体系中ATP含量随84消毒剂浓度的升高而降低，即C3体系最高(109.2%)，其次是C2体系(104.3%)、C4体系(96.6%)、C5体系(88.1%)，C6体系中ATP的含量最低(75.6%)。以上结果表明，当84消毒剂浓度小于2 mg/L时，84消毒剂对活性污泥中ATP的产生具有促进作用，进而促进苯酚的降解；而当84消毒剂浓度大于2 mg/L时，84消毒剂活性污泥体系中ATP含量逐渐降低，进而抑制苯酚的降解。

图2 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中DHA活性和ATP含量的影响Fig.2 The effects of different concentrations of 84 disinfectant on DHA activity and ATP content in the SBR system

2.3 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中PHO和C23O活性的影响

微生物对苯酚的降解途径需要两个关键酶PHO和C23O，因此本研究通过检测两者的活性来表达微生物对苯酚的降解能力[8]。各体系PHO活性的变化情况如图3(a)所示，以对照组(C1体系)为100%，C2和C3体系中的PHO活性随84消毒剂浓度的升高而升高，从100.0%提高至111.4%，而C4、C5和C6体系中的PHO活性随84消毒剂浓度的升高而降低，从111.4%降低至74.4%。

从图3(b)中可以看出，各体系中C23O活性的变化与PHO活性的变化趋势一致。C2和C3体系中的C23O活性随84消毒剂浓度的增大而增大，从100.0%提高至109.1%。而C4、C5和C6体系中的C23O活性随84消毒剂浓度的升高而降低，从109.1%降低至77.0%。以上结果说明，低浓度的84消毒剂(小于2 mg/L)对活性污泥PHO和C23O活性有促进作用，而对于高浓度的84消毒剂(大于2 mg/L)，其毒性作用会使活性污泥体系中PHO和C23O的活性降低，进而对体系中苯酚的降解效率起到抑制作用。

图3 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中PHO和C23O活性的影响Fig.3 The effects of different concentrations of 84 disinfectant on the activities of PHO and C23O in the SBR system

2.4 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中ROS产生和LDH释放的影响

正常情况下，微生物细胞内ROS的含量较低，容易被中和。然而，当微生物受到外部刺激时，便会产生大量的ROS，如果ROS在细胞中大量累积，会促使微生物细胞因发生氧化应激反应而使得细胞结构受到严重氧化损伤[11-12]。ROS还可能攻击细胞质膜上的不饱和磷脂，导致脂质过氧化而损伤细胞膜。除此之外，胞内ROS大量积累会损伤单链DNA，进而影响微生物合成核酸、蛋白质等生理生化反应的正常运行[13]。如图4(a)所示，以C1体系中的ROS含量为100.0%，在C1、C2和C3体系中ROS含量无明显变化(均为100.0%)，说明84消毒剂浓度小于2 mg/L时未引起微生物细胞内的氧化应激反应，未对微生物细胞产生毒害；而C4、C5和C6体系中ROS含量随84消毒剂浓度的升高而升高(C4：103.6%、C5：119.6%、C6：188.9%)，尤其C6体系中ROS含量急剧升高至188.9%，说明高浓度的84消毒剂(大于2 mg/L)会引起微生物细胞内的氧化应激反应，对活性污泥体系中微生物细胞产生毒害作用，进而影响活性污泥体系的生理功能及理化性质。

图4 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中ROS产生和LDH释放的影响Fig.4 The effects of different concentrations of 84 disinfectant on ROS production and LDH release in the SBR system

LDH是一种胞内酶，既可以用LDH来反映微生物细胞膜的完整情况，也可以用其表达微生物细胞的毒性情况[14]，因此，本研究分别检测各反应体系中LDH的释放量。如图4(b)所示，以C1体系中的LDH释放量为100.0%，C1、C2和C3体系LDH释放量无明显变化(均为100.0%)，说明84消毒剂浓度小于2 mg/L时未对微生物细胞膜造成破坏，对微生物细胞几乎没有毒性；C4、C5、C6体系中LDH释放量随84消毒剂浓度的升高而升高(C4：106.0%、C5：124.0%、C6：181.0%)，尤其C6体系中LDH释放量急剧升高，达到181.0%，说明高浓度的84消毒剂(大于2 mg/L)会破坏微生物细胞膜，导致LDH的释放，进而对活性污泥体系的生理功能及理化性质产生影响。

2.5 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中EPS含量的影响

EPS是一种有机高分子聚合物，其主要成分为蛋白质(PN)和多糖(PS)。当外界有毒有害物质刺激微生物细胞时，微生物分泌的EPS会包裹在细胞外起保护作用[15]。因此，本研究分别检测不同浓度84消毒剂投加后EPS的含量。各体系的EPS中PN和PS含量如图5所示，C3体系中的PN和PS含量最低(PN：99.9 mg/L，PS：187.9 mg/L)，其次是C2体系(PN：112.4 mg/L，PS：196.6 mg/L)、C3体系(PN：113.9 mg/L，PS：199.1 mg/L)、C4体系(PN：114.3 mg/L，PS：203.5 mg/L)、C5体系(PN：127.8 mg/L，PS：209.8 mg/L)和C6体系(PN：160.6 mg/L，PS：274.8 mg/L)。综上所述，当84消毒剂浓度小于2 mg/L时，EPS中PN和PS含量随84消毒剂浓度的升高而降低，有研究表明EPS中PN和PS的合成与ATP有关[16]。因此，推测EPS含量下降的原因可能是低浓度84消毒剂(小于2 mg/L)增加了活性污泥的代谢活性，促使蛋白质和多糖被活性污泥利用，进而降低EPS含量[17]；而当84消毒剂浓度大于2 mg/L 时，EPS中PN和PS含量随着84消毒剂浓度的升高而增多，说明高浓度的84消毒液(大于2 mg/L)会对活性污泥中的微生物细胞产生毒害作用，从而刺激微生物释放更多的EPS来保护自身细胞，以减轻84消毒剂的毒害作用。

图5 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中EPS中蛋白质和多糖含量的影响Fig.5 The effects of different concentrations of 84 disinfectant on the contents of PN and PS in EPS in the SBR system

2.6 不同浓度的84消毒剂对SBR体系中EPS结构的影响

本研究利用3D-EEM光谱法进一步分析了不同浓度的84消毒剂对EPS中有机成分的影响。如图6所示，各SBR体系中EPS均有两个显著特征荧光峰A(Ex/Em=295/350 nm)和B(Ex/Em=350/450 nm)，荧光峰A代表溶解性微生物代谢蛋白物质，荧光峰B代表腐殖酸类物质。在低浓度84消毒剂(小于2 mg/L)条件下，荧光峰A和B的荧光强度与84消毒剂浓度成反比例关系；相反，在高浓度84消毒剂(大于2 mg/L)条件下，荧光峰A和B的荧光强度与84消毒剂浓度成正比例关系。结果表明，低浓度84消毒剂(小于2 mg/L)会使类蛋白物质和腐殖酸类物质的含量降低，然而高浓度84消毒剂(大于2 mg/L)则起到相反的效果。该结果与上述2.5中所述的EPS中PN和PS含量分析结果一致。

图6 各反应体系中EPS的三维荧光光谱图Fig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of EPS in each reaction system

3 结 论

(1)苯酚降解效率表明：当84消毒剂的浓度小于2 mg/L时，84消毒剂可促进SBR体系中的苯酚降解，其主要归因于低浓度的84消毒剂会促进DHA、苯酚降解酶活性及ATP的产生；当84消毒剂的浓度大于2 mg/L时，则抑制了苯酚的降解。综上，说明84消毒剂的最佳浓度阈值为2 mg/L。

(2)ROS和LDH含量检测表明：当84消毒剂的浓度小于2 mg/L时未对微生物细胞产生毒害作用，而高浓度的84消毒剂(大于2 mg/L)会对微生物细胞产生毒害作用，导致细胞膜破裂，大量的LDH释放到活性污泥体系中，进而影响SBR体系的生理功能及理化性质。

(3)EPS的含量分析表明：当84消毒剂的浓度小于2 mg/L时，EPS中PN和PS含量随84消毒液浓度升高而降低；当84消毒剂的浓度大于2 mg/L 时，EPS中PN和PS含量逐渐升高。3D-EEM分析表明：84消毒剂的浓度小于2 mg/L时，体系中类蛋白质和腐殖酸类物质的含量降低，而高浓度的84消毒剂(大于2 mg/L)则起到相反的作用。上述结果进一步说明2 mg/L为84消毒剂的最佳浓度阈值。