超声前处理对大豆分离蛋白水解度的影响

文超婷，张继贤*，段玉清

1. 扬州大学食品科学与工程学院（扬州 225127）；2. 江苏大学食品科学与工程学院（镇江 212013）

脱脂大豆粕是大豆提油后剩下的副产物，产量非常大，常用于饲养动物或以废物处理。大豆粕中含有高比例的蛋白质和优质氨基酸[1]。此外，一些研究表明大豆分离蛋白水解物还具有较好的生物活性[2-3]。大部分研究表明酶解法被普遍用于制备生物活性肽，然而，酶解法存在反应时间长、蛋白转化率低和成本高等缺点[4]。超声是一种新型、绿色、环保的方法，它能够弥补酶解法的不足。大量文献表明，超声波处理能够显著提高多肽的制备效率和改善生物活性[5-6]。然而，有关超声辅助酶解制备西瓜籽多肽的研究却未见报道。

因此，试验通过响应面分析，研究超声时间、超声功率、蛋白浓度和酶解温度对大豆分离蛋白水解度的影响，为超声前处理辅助蛋白酶解工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（山东西亚化工有限公司）；碱性蛋白酶（诺维信生物技术有限公司）；NaOH、浓盐酸（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

DL-5C离心机（上海安亭有限公司）；DHG-9920A电热鼓风干燥箱（上海恒科学仪器有限公司）；PHS-3C酸度计（上海理达仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 超声预处理酶解反应

将大豆分离蛋白粉配制成一定浓度的溶液，对蛋白溶液进行超声前处理。根据Wen等[7]的酶解方法，加入0.1 mol/L NaOH将蛋白溶液调至pH 9.0，加酶量为蛋白粉质量的1%，在50 ℃恒温水浴中酶解4 h。结束后加入0.1 mol/L NaOH溶液，调解至反应初始pH，记录NaOH溶液的消耗量。

1.3.2 水解度的测定

酶解过程中水解度的测定采用pH-start[8]法，计算公式见式（1）。

式中：V为酶解过程中所消耗的NaOH溶液体积，mL；n为NaOH溶液的浓度，mol/L；α为α-NH3平均解离度；m为样品中蛋白质质量，g。

1.3.3 单因素试验设计

1.3.3.1 超声前处理时间对蛋白水解度的影响

在超声功率200 W、底物浓度3.5 g/L、温度50 ℃条件下，超声前处理时间分别为10，20，30，40和50 min，加入碱性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，灭酶活力后，加入NaOH溶液，调解至反应初始pH，记录NaOH溶液的消耗量，并对水解度进行计算。

1.3.3.2 超声功率对蛋白水解度的影响

在底物浓度3.5 g/L、温度50 ℃和超声前处理时间30 min的条件下，超声前功率分别为100，150，200，250和300 W，加入碱性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，灭酶活力后，加入NaOH溶液，调解至反应初始pH，记录NaOH溶液的消耗量，并对水解度进行计算。

1.3.3.3 底物浓度对蛋白水解度的影响

在超声功率200 W、温度50 ℃和超声前处理时间30 min的条件下，底物浓度分别为2.5，3.0，3.5，4.0和4.5 g/L，加入碱性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，灭酶活力后，加入NaOH溶液，调解至反应初始pH，记录NaOH溶液的消耗量，并对水解度进行计算。

1.3.3.4 温度对蛋白水解度的影响

在超声功率200 W、底物浓度3.5 g/L和超声前处理时间30 min的条件下，温度分别为30，40，50，60和70 ℃，加入碱性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，灭酶活力后，加入NaOH溶液，调解至反应初始pH，记录NaOH溶液的消耗量，并对水解度进行计算。

1.3.4 Box-Behnken试验设计

在单因素试验的基础上，确定各因素的最佳水平范围，采用响应面中心组合试验设计，研究各参数对考察指标的影响规律，并得到最佳添加量条件。以超声前处理时间（A）、超声功率（B）、底物浓度（C）、温度（D）为自变量，以水解度为响应值，其因素水平编码见表1，响应面试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验因子水平及编码

1.3.5 数据处理采用SPSS 19.0数据分析软件进行变化显著性分析。使用Origin 2011软件对数据进行统计分析并绘制图表，使用Design Expert 8.0.6进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 超声前处理时间对蛋白水解度的影响

水解度能够反映蛋白酶解的程度。由图1可知，随着超声前处理时间的增加，蛋白水解度呈现先增加后下降的趋势，这表明适宜的超声前处理能够促进大豆分离蛋白的酶解程度。这种现象可能是由于超声波能够改变蛋白质的结构，暴露更多的酶切位点[9]。试验结果与Uluko等[12]报道的结果相一致，超声前处理能够显著提高牛奶蛋白的水解度。然而，当时间超过30 min后水解度呈现下降趋势，这主要是由于过长的时间会导致蛋白分子发生再聚集，不利于酶解反应的进行[10]。因此，选择超声前处理20，30和40 min用于后续试验优化。

图1 不同前处理时间对水解度的影响

2.1.2 超声功率对蛋白水解度的影响

由图2可知，随着超声功率的增加，蛋白水解度呈现先增加后下降的趋势，在功率为200 W时到达最大值，这表明超声在适宜的功率范围内，能够显著促进蛋白的酶解。随着超声功率的增加，水解程度的增加可归因于超声空化效应的增强，这是由于时间的推移，会产生更多的空化活性体积[11]。

图2 不同功率对水解度的影响

2.1.3 底物浓度对蛋白水解度的影响

从图3中可以看出，随着底物浓度的增加，蛋白水解度先增加后减少，在底物浓度4 g/L时达到最大值。底物浓度超过4 g/L时，蛋白水解度有所下降。考虑到尽可能少地使用原料，实现更多的酶解，选取3.0，3.5和4.0 g/L用于后续响应面优化试验。

图3 不同底物浓度对水解度的影响

2.1.4 温度对蛋白水解度的影响

不同温度对大豆分离蛋白水解度的影响如图4所示。随着温度的增加，水解度呈现逐渐上升的趋势，这可能是由于超声和热能够加速蛋白结构的改变，增加蛋白内部分子展开的速率，加速酶与底物的反应效率[12]。然而，温度超过50 ℃后水解度呈现下降的趋势，这可能是由于过高的温度会引起蛋白分子的聚集，阻碍酶解反应的进行[13]。因此，选择40，50和60℃用于后续响应面优化。

图4 不同温度对水解度的影响

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 模型建立与数据分析

基于单因素试验分析，根据Box-Behnken中心组合设计四因素三水平的响应面分析试验，试验方案根据表2的因素与水平设计，所得回归方程系数显著性检验结果见表3。

表2 响应面试验设计及结果

得到以水解度（Y）为响应值的四元二次回归方程：水解度（Y）=11.02-0.33A-0.16B+1.43C+0.25D+1.70AB-0.82AC+0.54AD+1.07BC-0.95BD-0.035CD-0.36A2-1.34B2+0.36C2-0.47D2。回归模型方差分析见表3。

由表3可知，所建立的水解度回归模型P=0.000 1，达到极显著水平，得出R2=0.995 3，失拟项（P=0.396 3）不显著，说明回归模型和预测值之间有较好拟合度。模型的一次项A、B、C、D（P＜0.01）影响极显著；二次项A2、B2、C2（P＜0.01）影响均极显著；交互项CD（P＞0.05）影响不显著，AB、AC、AD、BC、BD（P＜0.01）影响极显著。由此可知，4个因素对水解度影响的顺序为C＞A＞D＞B，即底物浓度＞时间＞温度＞功率。

表3 回归模型及显著性检验（水解度）

2.2.2 验证试验

软件给出的最优工艺参数为超声时间20 min、超声功率188.67 W、底物浓度4.0 g/L和酶解温度59.55℃，此时水解度为13.73%。选取超声时间20 min、功率190 W、样品浓度4 g/L、酶解温度60 ℃进行试验验证，水解度为13.61%±0.21%，接近预测值13.73%，工艺参数与软件给出预测值较吻合。因此，可作为最优工艺参数。

3 结论

通过单因素试验，确定超声前处理时间、超声功率、底物浓度、温度各因素在单一因素变化的情况下的最优值。以单因素试验的结果为基础，用响应面法对蛋白水解度进行优化，建立超声前处理时间、超声功率、底物浓度和酶解温度对水解度的二次回归方程模型。经验证，该数学模型可靠，可用于水解度优化参数的预测。结合单因素试验、响应面试验和验证试验，确定水解度最优超声前处理参数：超声时间20 min、超声功率190 W、蛋白浓度4 g/L和酶解温度60 ℃。在此最优工艺参数下大豆分离蛋白水解度为13.61%±0.21%。