罗汉参皮总黄酮的提取工艺优化及其抗氧化活性研究

宋代荣，刘昌衡,2，贾爱荣,2，白义化，苗佳琳，张绵松,2*

1. 齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省科学院生物研究所（济南 250103）；2. 中澳特色生物资源产业技术创新联合实验室（济南 250103）；3. 威海市宇王集团有限公司（威海 264500）

罗汉参（Apios americanaMedic.），又称美洲土栾（圞）儿、土栾（圞）儿、菜用土栾（圞）儿等，豆科土栾儿属，为多年蔓生草本植物，块根呈圆球形或不规则长圆形，长3～8 cm，表皮呈土黄色，上有断续的环状纹理，肉质洁白细嫩[1]。罗汉参主产于我国山东单县，由于其富含抗性淀粉[2]和膳食纤维，且营养丰富，同时含有多种氨基酸[3]及微量元素[4]，在民间长期作为一种保健食品食用。

由于罗汉参为地方中草药，对其进行的研究并不多。《全国中草药汇编》中记载土栾（圞）儿块根的主要成分是“淀粉”。对其化学成分的研究结果表明罗汉参中含有生物碱类成分。药效学试验表明，罗汉参总生物碱对人肺腺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞、人胰腺癌BxPC-3细胞、人恶性淋巴瘤Raji细胞有较好的抑制作用，因此，罗汉参可被称之为一种非常具有养生意义的功能性保健食材[5]。

罗汉参皮是食用和加工后的废弃物，其中含有多酚、黄酮、皂苷类化合物等。其中的总黄酮是一类在自然界广泛存在的多酚类物质，具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗突变、抗病毒和调节免疫等作用[6]。其作为一种广泛应用的抗氧化功能因子，应当被更有效地开发利用。总黄酮的提取方式主要包括水提法、微波法[7]、超滤法[8]和超声辅助提取法，其中超声辅助提取法具有提取率高、耗时少、提取物结构不易被破坏等优点，被广泛运用于黄酮类化合物的提取[9-11]。因此，试验对罗汉参皮总黄酮的超声辅助提取方法进行工艺优化，并进行抗氧化活性研究，旨在为罗汉参皮总黄酮的提取及其在抗氧化产品中应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

罗汉参（菏泽单县天祥罗汉参专业合作社）。将剥下的新鲜罗汉参皮在50 ℃下烘干，磨粉后过0.180 mm（80目）筛，放入干燥器备用。

1.1.2 试剂

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH；Sigma-Aldrich，Germany）；Griess reagent（Sigma-Aldrich，Germany）；2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS；Sigma-Aldrich，Germany）；芦丁标准品（CAS153-18-4，麦克林）；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

Centrifuge 580412型离心机（Germany）；EX124ZH/AD型电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]；SCIENTZ-950E超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；M200pro型酶标仪（瑞士TECAN）。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验设计

分别称取0.500 g罗汉参皮粉末，置于5个EP管中，分别加入一定量的乙醇溶液，在一定的温度下超声提取一定时间后，取出EP管，在6 000 r/min的条件下离心15 min，取上清液测定总黄酮含量。依次考察乙醇体积分数、提取时间、料液比、超声功率和提取温度对总黄酮得率的影响。单因素基础试验条件：乙醇溶液体积分数70%、提取时间6 min、料液比1∶10（g/mL）、超声功率60 W、提取温度40 ℃。各因素取值范围：乙醇体积分数50%，60%，70%，80%，90%和100%；提取时间3，6，9和12 min；料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL）；超声功率30，60，90和120 W；提取温度10，25，40，55和70 ℃。

1.2.2 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理[12-15]，以乙醇体积分数（X1）、超声波功率（X2）和料液比（X3）为自变量，以总黄酮得率为响应值，设计三因素三水平试验。响应面试验设计因素水平见表1。

表1 响应面试验设计因素水平表

1.2.3 统计分析

试验重复3次，结果取平均值，采用Design Expert软件对数据进行响应面分析，包括显著性差异、方差分析、最佳试验条件和最佳响应值预测。

1.2.4 总黄酮含量的测定

1.2.4.1 芦丁标准曲线的制作

参考Moreno等[16]的方法，准确称取10 mg芦丁标准品，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到质量浓度100 μg/mL的芦丁标准溶液。依次将溶液稀释到20，40，60，80和100 μg/mL，取120 μL不同浓度稀释的芦丁标准品溶液，加水稀释至960 mL，分别向其中加入64 μL质量浓度50 mg/mL的亚硝酸钠溶液，混合均匀，室温孵育6 min后，加入64 μL的AlCl3溶液（100 mg/mL），混合均匀，室温孵育5 min后，加入800 μL的NaOH溶液（40 mg/mL），混合均匀，避光，室温孵育30 min，用酶标仪在410 nm波长下进行检测。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作芦丁标准曲线，所得的标准曲线方程为y=0.004 9x+0.057 1（R2=0.999 1）。

1.2.4.2 罗汉参皮总黄酮得率计算

离心后的提取液按标准曲线相同操作测定罗汉参皮总黄酮的吸光度，利用标准曲线方程计算出提取液中总黄酮浓度，并按式（1）计算罗汉参皮总黄酮得率（mg/g）。

1.2.5 DPPH清除率的测定[17]

取0.1 mL样品液，加入0.9 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（99%乙醇溶解），漩涡振荡混匀10 s后，置于暗室反应30 min。在517 nm处测各样品的吸光度。对照组取乙醇代替样品液。得出的数据按式（2）计算处理，得到DPPH清除率。

1.2.6 ABTS自由基清除活性测定

ABTS自由基的测定参照Alañón等[18]方法。将ABTS母液（7 mmol/L）和过硫酸钾溶液（2.4 mmol/L）等体积混合，室温放置12～16 h。用乙醇稀释至吸光度稳定在0.7±0.02（稀释比例约1∶48）为止，即制成ABTS工作液，将稀释到适当浓度的样品溶液加到96孔板中，加入200 μL新鲜配制的ABTS工作液，室温条件下避光孵育5 min。用酶标仪在734 nm波长下检测吸光度。自由基清除率按式（3）计算。

式中：AS为样品溶液吸光度；A0为空白溶液吸光度。

1.2.7 还原力的测定

还原力测定方法参照Arabshahi-Delouee等[19]的方法。准确量取0.4 mL样品液（0.05～0.20 mg/mL）或空白溶液（蒸馏水），加入1 mL磷酸缓冲液（0.2 mol，pH 6.6）及1 mL 1%铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）溶液，混合均匀后，于50 ℃水浴孵育20 min；加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液，室温孵育10 min。取1 mL上述溶液，加入1 mL蒸馏水和0.2 mL 0.1%氯化铁溶液，均匀混合，用分光光度计在700 nm处测定吸光度。

1.2.8 总抗氧化能力的测定

将0.1 mL样品（0.2～1.0 mg/mL）的等分试样与1 mL磷钼试剂一起加入试管中。试管在90 ℃孵育90 min。让每个样品在室温下冷却，在695 nm处读取吸光度。对照溶液由1 mL试剂溶液和0.1 mL蒸馏水组成。吸光度越大则表明总的抗氧化能力越强。

1.3 数据分析方法

试验各组数据均以“均值±标准差”表示，应用SPSS 20.2软件处理各组数据，采用One Way ANOVA法分析各组试验数据之间的差异显著关系。若计量资料的方差齐，采用单因素方差分析LSD检验进行组间比较。若计量资料的方差不齐，采用单因素方差分析Dunnett T3检验。其中，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。响应面试验中采用Design Expert 8.0软件制图。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

如图1所示，乙醇体积分数在50%～90%时，总黄酮得率随乙醇体积分数升高而增大，乙醇体积分数90%时达到最高值，为7.93±0.48 mg/g。随着乙醇体积分数继续升高，总黄酮得率没有显著变化，所以最佳乙醇体积分数为90%。

图1 乙醇体积分数对罗汉参皮总黄酮得率的影响

2.1.2 提取时间对总黄酮得率的影响

如图2所示，提取时间6 min时，总黄酮得率与9和12 min的总黄酮得率无显著差异，所以提取时间设为6 min。

图2 提取时间对罗汉参皮总黄酮得率的影响

2.1.3 料液比对总黄酮得率的影响

如图3所示，料液比1∶10～1∶40（g/mL）时，总黄酮得率随溶剂比例增加而升高，料液比到达1∶40（g/mL）时，总黄酮得率达到最高值10.39±0.20 mg/g，继续增加溶剂比例并不能提高总黄酮的得率，其原因可能是乙醇溶液与罗汉参皮的边界层浓度差变小，总黄酮的扩散到达平衡状态[20]。

图3 料液比对罗汉参皮黄酮得率的影响

2.1.4 超声功率对总黄酮得率的影响

超声波振动可以产生强烈的机械效应、空穴效应及热效应，促进更高的物质溶出率[21]。超声功率单因素试验结果如图4所示。超声功率30～90 W时，总黄酮得率随着功率增加而上升。超声功率90 W时，得率为10.14±0.05 mg/g，达到最高值。随着超声功率继续升高，总黄酮得率没有显著上升，甚至在150 W时略有下降。

图4 超声功率对罗汉参皮黄酮得率的影响

2.1.5 提取温度对总黄酮得率的影响

不同温度对罗汉参皮总黄酮得率的影响结果如图5所示。提取温度10～40 ℃时，得率随温度升高而增加，提取温度40 ℃时得率达到最高值10.62±0.66 mg/g。随着提取温度继续升高，部分热敏性总黄酮可能被破坏，导致总黄酮得率降低。

图5 提取温度对罗汉参皮总黄酮得率的影响

2.2 响应面试验分析

2.2.1 响应面优化试验结果

在单因数试验结果的基础上，以乙醇体积分数、超声波功率和提取温度为因素，以罗汉参皮总黄酮得率为响应值，设计响应曲面试验，试验结果见表2，对各因素的方差分析结果见表3。

对表2试验数据进行回归拟合分析，得到以总黄酮得率Y为响应值的回归方程：Y=9.61+0.95X1-0.041X2+0.60X3-0.48X1X2+0.11X1X3+0.10X2X3-2.20-0.35+0.039。

表2 响应面分析方案及试验结果

由表3可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明该模型误差小。R2值为0.986 5，R2 adj值为0.962 1，C.V.值为0.817 8%，说明模型拟合度良好。方差分析检验结果显示，乙醇体积分数、料液比及乙醇体积分数的平方项对罗汉参皮总黄酮得率均有极显著影响（P＜0.01），乙醇体积分数和超声功率对罗汉参皮总黄酮得率影响显著（P＜0.05）。依据回归方程系数可知，3个因素对罗汉参皮总黄酮得率影响顺序为乙醇体积分数（X1）＞料液比（X3）＞超声功率（X2）。

表3 方差分析结果

2.2.2 各因素交互作用分析

方差分析检验结果显示，乙醇体积分数的平方项对罗汉参皮总黄酮得率均有极显著影响（P＜0.01），乙醇体积分数和超声功率的交互项对罗汉参皮总黄酮得率的影响显著（P＜0.05）。通过Design-Expert 8.0.6.1软件绘制相应的响应面图，结果如图6所示。

图6 各因素交互作用对罗汉参皮总黄酮得率影响的响应面图

X1X2对罗汉参皮总黄酮得率的影响是一个球形曲面，在各个方向都是先增加后减少的趋势，响应面的最高点对应的X1和X2的坐标取值即为最优条件。X1X3对响应值影响在不同的方向是不一样的，是一个鞍型曲面；而X2X3的影响则是一个接近平面的曲面，说明其影响不显著。

2.2.3 验证性试验

根据响应面回归模型预测可得最佳提取工艺参数：乙醇体积分数95.7%、超声功率120 W、料液比1∶46（g/mL），此时罗汉参总黄酮得率最高预测值为9.244 mg/g。为方便试验操作，确定其最终提取工艺条件：乙醇体积分数96%、超声功率120 W、料液比1∶46（g/mL）。在此最优组合下进行3次平行验证试验，罗汉参皮总黄酮得率平均值为9.116 mg/mL，与预测值相近，进一步证明该模型的可信性。

2.3 罗汉参皮总黄酮的抗氧化活性分析

2.3.1 样品前处理

将提取的罗汉参皮总黄酮进行等梯度稀释，以等浓度VC作为对照进行抗氧化活性的测定。

2.3.2 DPPH清除率

如图7所示：罗汉参皮总黄酮和VC清除率都随着各自质量浓度上升而有所提高，但是罗汉参皮总黄酮对DPPH自由基清除能力明显低于VC，0.1 mg/mL时罗汉参皮总黄酮清除率不到20%，而VC清除率达80%以上。最终在质量浓度0.6 mg/mL时，罗汉参皮总黄酮清除率可达到60%左右。刘青等[22]对山药皮中总黄酮的抗氧化性进行研究，提取的山药皮总黄酮对DPPH清除作用随提取物浓度增加而增加，而且在质量浓度0.01 mg/mL时，清除率约15%，这与试验结果相似。王晓琳等[23]在对黄芪茎总黄酮的研究中测得，在质量浓度0.1～0.6 mg/mL时，黄芪茎黄酮对DPPH清除率持续上升，这与试验结果中清除率的趋势一致。

图7 罗汉参皮总黄酮及VC对DPPH·的清除作用

2.3.3 ABTS自由基清除活性

如图8所示：0.1 mg/mL VC的ABTS自由基清除活性达100%；罗汉参总黄酮在0～0.4 mg/mL质量浓度范围内，其ABTS自由基清除活性随质量浓度上升而快速升高。在0.4 mg/mL时清除活性接近100%。张静等[24]对桦褐孔菌黄酮类化合物的研究中指出，优化提取工艺后得到的黄酮类化合物在质量浓度0～0.8 mg/mL时对ABTS自由基清除效果随着浓度增大而上升，在0.8～1.0 mg/mL质量浓度时与VC清除率相似。这表明罗汉参皮总黄酮的ABTS自由基清除活性优于桦褐孔菌黄酮类化合物的清除活性。

图8 罗汉参皮总黄酮及VC对ABTS·的清除作用

2.3.4 还原力测定

如图9所示：罗汉参皮总黄酮和VC总还原力都随着浓度上升而升高。在1～0.2 mg/mL浓度区间，VC和罗汉参皮总黄酮的还原力与浓度都呈线性关系，但是VC还原力较大，而且上升较快。在0.2～0.6 mg/mL浓度区间，VC和罗汉参皮总黄酮还原力与浓度也都呈线性关系，而且直线的斜率相近。

图9 罗汉参皮黄酮及VC总还原力的测定

2.3.5 总抗氧化测定

如图10所示：罗汉参皮总黄酮和VC的总抗氧化能力均随着质量浓度上升有显著提高。质量浓度在0.155 mg/mL时，两者总抗氧化能力相近，VC总抗氧化能力急剧上升而罗汉参皮总黄酮的总抗氧化能力上升速率相对缓慢。

图10 罗汉参皮总黄酮及VC总抗氧化的测定

3 结论

试验利用超声波辅助提取罗汉参皮中的总黄酮，通过响应面试验分析得出最佳提取工艺：乙醇体积分数95.7%、超声功率120 W、料液比1∶46（g/mL）、提取温度40 ℃、提取时间6 min，在该条件下总黄酮得率为9.116 mg/g。对提取的罗汉参皮总黄酮进行DPPH清除率、ABTS清除活性、还原力和总抗氧化能力4项抗氧化活性分析时发现，罗汉参皮总黄酮在这4项抗氧化活性测试中均表现出浓度依赖性，浓度越高，活性越好。在质量浓度0.6 mg/mL时，罗汉参皮总黄酮的DPPH清除率可达60%左右；在0.4 mg/mL时ABTS清除活性接近100%；在0～0.6 mg/mL质量浓度区间，罗汉参皮总黄酮的还原力与浓度呈线性关系；在0～1 mg/mL质量浓度区间，罗汉参皮总黄酮的总抗氧化能力与浓度也呈线性关系。这些体外量效关系研究为罗汉参皮总黄酮的应用提供参考。