木瓜蛋白酶联合沙蒿籽胶对面团的增筋作用及机理研究

卫晓怡，苏婷婷，司晓晶，张路遥，韩梅，崔琳琳

(上海商学院 酒店管理学院食品系，上海，200235)

随着食品工业水平的发展，对耐机械加工和发酵稳定性高的高筋小麦粉的需求量持续增高[1]。我国小麦品种众多，受限于种植水平、种植环境和管理难度，其品质差异较大，变异系数高达75.6[2]。针对这种面团流变特性及加工品质变异范围大以及优质高筋粉欠缺等问题，亟待开发安全有效的面筋强化剂。

目前常用面粉增筋剂为偶氮甲酰胺(azoformamide)，据报道，偶氮甲酰胺可能危害呼吸系统以及导致皮肤敏感反应，其安全性在日本及欧盟地区受到质疑而被禁用，我国和美国将其列为限量添加(<0.045 g/kg)。更安全的食用胶体在当下逐渐成为一个热门话题，这类物质在面团形成初期就以紧密的三维网状结构包裹面粉中存在的细小淀粉颗粒，并在发酵产气内部体积扩张后，避免脆弱的面筋网络受影响而破裂，仍然能够维持联结结构[3]。沙蒿籽胶(ArtemisiasphaerocephalaKrasch gum，ASKG)提取自植物，是一种高安全性、高吸水性和高黏性的食用胶[4]，具有抗糖尿病、肥胖和降血糖等生理功效，但沙蒿籽胶过多添加会使得面筋蛋白之间交联过于紧实而弹性不足，影响口感[5]。

木瓜蛋白酶(papain，巯基蛋白酶)具有酶活力高、热稳定性好及天然安全等特点，常用于面制品减筋，使面团具有良好的可塑性和延伸性[6]。然而，酶水解的蛋白也可产生连接作用，如木瓜蛋白酶可以使大豆蛋白—SH、—S—S—和疏水性氨基酸残基暴露，随即通过疏水、二硫键等作用促使蛋白形成凝胶[7-8]。本研究团队在前期实验中发现，木瓜蛋白酶对面团形成具有潜在的增筋效果，轻度水解时湿面筋含量下降，但面筋指数反而升高，其作用机理亟待探讨。

复配添加剂的使用往往对改良小麦粉品质有较好的效果。本研究探讨木瓜蛋白酶联合沙蒿籽胶添加对面团的增筋作用与机理，以期为探究替代偶氮甲酰胺的天然增筋剂提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售面粉(蛋白质10%)，潍坊风筝面粉有限责任公司；酵母粉，安琪酵母股份公司；木瓜蛋白酶(60 000 U/g以上)，南宁庞博生物工程有限公司；沙蒿籽胶(含量98%，食品级)、偶氮甲酰胺(含量99%，食品级)，河北百味生物科技有限公司。彩色预染蛋白质分子质量标准(10～180 kDa)，BeyoColorTMP0069。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

2200型面筋仪，波通瑞华科学仪器(北京)有限公司；5425型台式离心机，德国Eppendorf；FD-1D-50A型真空冷冻干燥机，上海欧蒙；MX-S型旋涡式振荡器，美国Scilogex；Multiskan SkyHigh型紫外/可见光分光光度计、Apreo型扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)，赛默飞；Bio-Rad型电泳仪，美国伯乐；ZF288型全自动凝胶成像分析，上海嘉鹏科技ZF288。

1.3 实验方法

1.3.1 木瓜蛋白酶水解酶活力测定

以酪蛋白为底物，采用分光光度法测定蛋白酶活力，以1 min水解产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位(U)。测得木瓜蛋白酶活力为72 000 U/g。木瓜蛋白酶使用量以面粉质量计。

1.3.2 湿面筋量、面筋指数的测定

适量小麦粉中分别加入不同剂量的木瓜蛋白酶、沙蒿籽胶、偶氮甲酰胺，混匀。采用面筋仪测定湿面筋量、面筋指数，称取各处理组小麦粉(10.00±0.01)g(添加剂含量低，其质量忽略不计)，添加5 mL蒸馏水，面团混合20 s后按暂停键暂停，取出面团放入不同温度的恒温箱保持静置55 min。将反应后的面团再和面5 min，放入面筋仪启动后续程序，参考GB/T 5506.2—2008《小麦和小麦粉面筋含量 第2部分：仪器法测定湿面筋》、LS/T 6102—1995《小麦粉湿面筋质量测定法面筋指数法》测定湿面筋量和面筋指数。

1.3.3 酶反应后醇溶蛋白和谷蛋白的提取

称取1 g木瓜蛋白酶加入小麦粉至180 g，搅拌混匀后取1 g，加入小麦粉至100 g混匀，即在小麦粉中添加4 U/g木瓜蛋白酶，通过面筋仪制备湿面筋：称取小麦混合粉(10.00±0.01) g，添加5 mL蒸馏水，面团混合20 s后按暂停键暂停，保持静置达30、60、90、120、150、180、210、240 min等反应时间，再继续启动洗涤5 min，水溶性和盐溶性蛋白、酶等物质被洗去，完成湿面筋制备。对照样为无添加小麦粉。取出湿面筋立即真空冷冻干燥，冻干粉在研钵中磨碎，加入150 mL的HCl溶液(2×10-3mol/L)，磁力搅拌20 min后离心10 min (5 000 r/min)，同样方法重复3次，分别合并3次分离的上清液(Glu，即酸溶蛋白)和沉淀(Gli，即酸不溶蛋白)。上清液定容至500 mL，沉淀加入500 mL体积分数70%乙醇溶解并定容，2种蛋白组分溶液待测。

1.3.4 醇溶蛋白和谷蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝G-250法测定各蛋白组分的含量。取Glu、Gli蛋白提取液各0.1 mL，加入0.9 mL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，放置2 min，于595 nm下比色测定吸光度(比色应在1 h内完成)，并用标准牛血清白蛋白作标准曲线，按公式(1)计算蛋白含量，按公式(2)计算m(Gli)/m(Glu)比值：

(1)

(2)

式中：C，蛋白含量，%；m1，Glu或Gli蛋白质量，g；m2，小麦粉质量，g；m(Gli)/m(Glu)，醇溶蛋白与谷蛋白质量比；m3，Gli蛋白质量，g；m4，Glu蛋白质量，g。

1.3.5 醇溶蛋白和谷蛋白的SDS-PAGE分析

取Glu、Gli蛋白提取液各0.1 mL，加入0.9 mL蒸馏水、0.25 mL非还原性溴酚蓝上样缓冲液以及4滴丙三醇于指型管中，沸水浴5 min后摇匀。采用质量分数5%浓缩胶和12%的分离胶对蛋白组分进行分析。上样量为15 μL，浓缩胶电压80 V，分离胶电压180 V，溴酚蓝指示剂迁移至胶底时停止电泳，小心取下凝胶，进行考马斯亮蓝染色液(2∶1)染色50 min，乙酸溶液反复脱色至条带清晰。

1.3.6 馒头制作方法

小麦粉与蒸馏水按质量比2∶1与质量分数1%酵母粉放入和面机中，和面10 min，在30 ℃，相对湿度70%的醒发箱中发酵30 min，取出发酵面团切成70 g，手工搓揉成馒头胚型后继续醒发20 min，放入冷水锅内，水沸后计时蒸制20 min，取出馒头冷却30 min待测。用排油菜籽法测定馒头体积并按公式(3)计算比容：

(3)

式中：P，比容，mL/g；V，馒头体积，mL；m，馒头质量，g。

1.3.7 面团结构的扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)分析

将馒头样品切成薄片冷冻干燥，离子溅射仪喷金后，以扫描电镜放大×600/×10 000倍成像面筋三维网络结构。

1.3.8 数据及响应面分析

采用SPSS 18.0中的Duncan’s进行数据的差异性分析，P<0.05表示显著性差异。结果以平均值±标准差表示。根据单因素试验结果，采用Design-Expert 12作响应面分析。

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶添加对面筋的影响

2.1.1 木瓜蛋白酶对湿面筋量与面筋指数的作用

在面粉中添加木瓜蛋白酶制作面团，木瓜蛋白酶添加量与湿面筋量倒数呈正相关性，R2=0.938 2(图1)。湿面筋量随着木瓜蛋白酶添加量增加而减少，当木瓜蛋白酶添加量>5 U/g时湿面筋量减少速度加快。此结果表明，低剂量木瓜蛋白酶(<5 U/g)可使面筋在1 h内轻度水解，与已有相关研究结果一致[6]，木瓜蛋白酶打断二硫键而水解不溶的小麦蛋白为可溶性的多肽，导致湿面筋量减少。一般来说，酶水解导致的湿面筋含量减少会引起面筋指数的同步降低。然而，本研究结果显示，随着木瓜蛋白酶的添加，与其相应的面筋指数呈先缓慢上升而后下降的趋势，呈线性不相关，R2=0.286 2(图2)，在木瓜蛋白酶添加量为3～8 U/g时，面团有较高的面筋指数值，酶添加量>8 U/g时面筋指数迅速下降。

图1 木瓜蛋白酶添加量与面团湿面筋量的相关性分析Fig.1 Correlation analysis between papain addition and gluten content of dough注：图上标不同字母表示显著性差异(P<0.05)(下同)

图2 木瓜蛋白酶添加量与面团面筋指数相关性分析Fig.2 Correlation analysis between papain addition and gluten index of dough

有研究通过添加Glu和Gli构建重组粉，随着重组粉中m(Gli)/m(Glu) 的减小，湿面筋含量下降，而面筋指数上升[9]，增加Glu的面团存在更紧密、牢固而有弹性的面筋蛋白网络微观结构[10]。

2.1.2 木瓜蛋白酶对Glu和Gli蛋白的影响

Glu、Gli是构成小麦粉蛋白的两大组分，通常Gli占比略高，但在实际分离提取过程中受多种因素影响，所得Glu、Gli含量存在较大差异[11]。本实验结果显示，原小麦粉Glu含量为(3.53±0.03)%、Gli含量为(4.02±0.04)%，m(Gli)/m(Glu)为1.14，随着小麦粉中添加4 U/g木瓜蛋白酶反应时间的延长，在1 h内，木瓜蛋白酶对Gli的水解速度快于Glu，m(Gli)/m(Glu)比值显著降低至0.72(P<0.05)，反应超过1 h后，Gli含量基本保持不变而Glu持续水解，2 h后m(Gli)/m(Glu)比值转而升高(表1)。

表1 木瓜蛋白酶反应时间对小麦粉中Glu、Gli以及m(Gli)/m(Glu)的影响Table 1 Effects of papain reaction time on Glu, Gli and m(Gli)/m(Glu) in wheat flour

非还原蛋白质电泳结果显示(图3)，Glu电泳条带在240 min内随着木瓜蛋白酶(4 U/g)作用时间的延长而逐渐变浅，而Gli在60 min内快速酶解，表明木瓜蛋白酶对Gli较Glu有更快的降解速度。使用木瓜蛋白酶时，Gli先被大量酶解，使表现高筋力的Glu占比暂时提升，m(Gli)/m(Glu) 减小导致面筋指数增大，但是随着Glu被木瓜蛋白酶继续酶解，面筋指数随m(Gli)/m(Glu) 的变大而有所降低。这与上述测定Glu、Gli含量比值的变化趋势一致。

上述结果表明，木瓜蛋白酶对Gli和Glu的酶解速率不同而导致m(Gli)/m(Glu)比值先下降后升高，反映在面筋指数呈先上升随后下降的变化趋势。小麦粉在木瓜蛋白酶添加量4 U/g下，1～2 h内m(Gli)/m(Glu)比值下降至最低并保持稳定(表1)，酶在此作用浓度和时间范围内，有助于提升Glu在面筋蛋白中的占比，Gli分散在Glu膨润状态下形成的网状结构中[9-10]，利于提高面筋指数。

a-谷蛋白；b-醇溶蛋白图3 木瓜蛋白酶解小麦谷蛋白和醇溶蛋白的SDS-PAGE图Fig.3 SDS-PAGE of wheat protein (Glu and Gli) hydrolyzed by papain

2.2 沙蒿籽胶添加对面筋的影响

沙蒿籽胶添加量与湿面筋量、面筋指数呈正相关，分别为R2=0.850 8(图4)、R2=0.853 2(图5)，沙蒿籽胶质量分数0.5%～1.0%，可使湿面筋量迅速增加，而在质量分数0.5%～2.0%，面筋指数逐步增加。有研究表明，当沙蒿籽胶添加量>1.5%时，面包感官评分呈下降趋势[5]。综合考虑，质量分数0.5%～1.5%的沙蒿籽胶较适用于小麦粉增筋。

图4 沙蒿籽胶添加量与面团湿面筋量相关性分析Fig.4 Correlation analysis between ASKG addition and gluten content of dough

2.3 木瓜蛋白酶联合沙蒿籽胶复配优化及对馒头制品的影响

2.3.1 响应面法优化面团制作

图5 沙蒿籽胶添加量与面筋指数相关性分析Fig.5 Correlation analysis between ASKG addition and gluten index of dough

根据上述单因素试验结果，同时考虑酵母最佳发酵温度为25～35 ℃，采用3因素3水平Box-Behnken试验设计响应面法确定最优复配比例，因素编码及水平见表2。面筋指数反映面团的弹性和延展性，因此，以各因素对面筋指数的影响来判断改良效果和确定最优复配比例。

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Factors and their levels of response surface design

通过 Design Expert 软件对响应面试验结果(表3)进行多元回归拟合，得到面筋指数(Y，%)对温度、木瓜蛋白酶及沙蒿籽胶的二次多项回归方程：

Y=-104.181+9.386A+10.739B+42.499C+0.110AB-0.162A2-1.849B2-19.967C2

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental data

表4 回归模型方差分析结果Table 4 Analysis of variance for the proposed regression model

根据回归方程及方差分析得响应面图(图6)，各因素相互之间的影响均呈先增后减的抛物线型关系，均有一个极大值点。

a-木瓜蛋白酶添加量与温度;b-沙蒿籽胶与木瓜蛋白酶添加量;c-沙蒿籽胶添加量与温度图6 木瓜蛋白酶、沙蒿籽胶和温度等各因素影响面团面筋指数的响应面图Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters (papain, ASKG and temperature) on the gluten index of dough

在所选择的试验范围内，依据一次项回归系数绝对值的大小可知因素的主效应关系为：沙蒿籽胶>木瓜蛋白酶>温度。温度影响木瓜蛋白酶的酶解能力而两者产生交互作用(表4)。

通过求解回归方程，复配添加剂形成面团的最佳条件为:温度30.7 ℃，木瓜蛋白酶添加量3.9 U/g，沙蒿籽胶添加量1.1%，在此条件下形成的面筋指数预测值为84.7%，相应条件下验证实验所得值为86.11%(表5)，实际值与预测值之间的相对误差为1.6%，预测与实际较相符。

对比各组，木瓜蛋白酶与沙蒿籽胶复配添加组的湿面筋含量为(36.22±0.52)%，面筋指数为(86.11±1.54)%，分别是未添加组的1.36和1.55倍(表5)。木瓜蛋白酶与沙蒿籽胶复配添加可改善面团品质，优于沙蒿籽胶或偶氮甲酰胺单独使用(P<0.05)，是优良而安全性高的小麦粉增筋剂。以木瓜蛋白酶轻度酶解面筋蛋白，有利于减少沙蒿籽胶作为增筋剂的添加量，减少对口感的影响。

表5 不同添加剂对面团湿面筋量、面筋指数的影响Table 5 The influence of different addition agents on wet gluten content and gluten index of dough

2.3.2 复配添加剂对馒头制品的影响

与无添加组或偶氮甲酰胺添加组(0.02 g/kg)对比，在最优化复配(沙蒿籽胶1.1%，木瓜蛋白酶3.9 U/g)条件下制作的馒头体积有显著提高，三者比容分别为(1.96±0.16)、(2.30±0.15)、(2.69±0.11) mL/g(P<0.05)。切开馒头从内部结构看，无添加组(图7-a)由于面筋的延展性不够而出现表皮与内芯分离现象；同时由于面筋的弹性不足而导致发酵产气膨胀而破坏面筋网络结构，部分相邻气孔合并为大气孔，孔径大小不均匀、结构较粗糙。偶氮甲酰胺添加组(图7-b)的气孔基本均匀，但仍存在个别大气孔。与此相对应的是，复配添加组(图7-c)的气孔细腻均一、弹性较足，表明面筋网络结构有显著增强，限制了发酵气体膨胀对面团结构的有害影响。

a-无添加；b-偶氮甲酰胺添加；c-木瓜蛋白酶-沙蒿籽胶复配添加图7 不同添加剂对馒头外观品质的影响Fig.7 Effect of different addition agents on the appearance quality of steamed bread

电镜微观研究表明，亲水胶体会阻碍面筋蛋白网络结构的形成。张帅[12]通过SEM探究了添加0.6%沙蒿籽胶的面团的微观结构，发现面筋蛋白的连续性受到破坏，然而又因沙蒿籽胶具有较高黏性，可将散碎的面筋蛋白粘合起来，对馒头比容没有显著影响，仍可提供馒头形状结构的支撑，且使馒头更耐老化，并不影响色泽与口感。因此，对于添加亲水胶体的面团，仅仅考察面筋形成阶段蛋白的联结，并不能客观反映面团加工特性改良情况。为此，本研究通过扫描电镜分析沙蒿籽胶对馒头微观结构的影响。

通过SEM分析得到×600和×10 000放大倍数下的馒头内部微观组织结构(图8)，馒头样品600倍放大SEM图像显示，无添加组(图8-a)有大量的散落小颗粒附着于面筋网络结构之上且互相无联结，这些小颗粒的主要成分应为淀粉物质与少量的面筋蛋白。在偶氮甲酰胺添加组中(图8-c)，大部分小颗粒与面筋网络结构较疏松地联结，形成一个较完整的整体。木瓜蛋白酶和沙蒿籽胶复配添加组(图8-d)中能够看到在其面筋蛋白网络结构中有大量紧密结合的小粒径颗粒，几乎无独立小颗粒存在于整体结构之外。以放大10 000倍图像观察，无添加组(图8-b)的蛋白网络结构有不连续相和空洞，偶氮甲酰胺添加组(图8-d)的蛋白质基质呈簇状的略不均匀分布且网络结构疏松，木瓜蛋白酶和沙蒿籽胶复配添加组(图8-e)的网络结构有较好的连续和融合性。

a-无添加，×600倍；b-无添加，×10 000倍；c-偶氮甲酰胺添加，×600倍；d-偶氮甲酰胺添加，×10 000倍；e-木瓜蛋白酶-沙蒿籽胶添加，×600倍；f-木瓜蛋白酶-沙蒿籽胶添加，×10 000倍图8 不同添加剂对馒头微观组织结构的影响Fig.8 Effect of different addition agents on the microstructure of steamed bread

3 讨论

Glu分子内及分子间均有二硫键，主要决定面团的弹性；Gli通过氢键和疏水作用相互反应，与面团黏性和延展性有关。本研究结果表明，木瓜蛋白酶对Glu和Gli的酶解速率不同，可降低m(Gli)/m(Glu)比值以提高小麦粉面筋指数，具有一定增筋效果。据相关文献报道，添加0.475%(E/S，换算为19 U/g)的木瓜蛋白酶在60 ℃下1.63 h，可使谷朊粉酶解达最大值[13]，或者添加0.15%(E/S，换算为9 000 U/g)的木瓜蛋白酶可在15 min内充分水解小麦蛋白[14]，采用高剂量的酶或长时间反应都可充分水解蛋白为可溶性多肽，不适用于面筋改性。也有研究表明，酶促大豆蛋白凝固的木瓜蛋白酶使用量为510 U/g[7]，这与本研究3.9 U/g的最佳添加量不同，推测是因为酶对大豆蛋白和小麦蛋白的作用机理不同。有研究通过向小麦粉直接添加相应组分来调整m(Gli)/m(Glu)比值[9]，也有研究发现小麦在一定的储藏期Gli含量降低，Glu逐渐增加，但蛋白质总量不变，这种储藏期蛋白组分的变化是小麦粉烘焙性能随之提高的重要原因[15]。

已有研究表明，沙蒿籽胶作为食用胶体添加后与水结合会形成类凝胶的物质，更好地包裹住面粉中的细小物质，其中包括部分可能会在洗面筋时流失的面筋蛋白和细小淀粉颗粒，同时也会通过类似凝胶包裹的作用覆盖面团联结网络，形成软性保护层以增加网络结构的韧性[16-17]。在这样的吸水性和黏性提升作用之下，不仅增加面团的总量，也在一定程度上改善了面筋的质量。已有研究表明，在面粉中添加不超过1.0%的沙蒿籽胶，面团稳定时间延长[12,18]，面条品质最佳[19]，这与本研究中沙蒿籽胶在小麦粉中的最佳添加量为1.1%的结果基本一致。

沙蒿籽胶常与其他增筋剂复配使用，提升增筋效果，同时可避免高剂量引起的高硬度影响到面制品口感。已有研究表明，复配添加3%谷朊粉和2%沙蒿籽胶(占燕麦粉和面包粉总质量)的高纤燕麦面包的品质达到最优[20]。发酵改性玉米面条的最佳复配添加为6%谷朊粉、1.2%沙蒿籽胶、0.6%黄原胶[21]。在小麦和鹰嘴豆复合面粉中，添加0.03%～0.5%的沙蒿籽胶有利于面团黏弹性增加，高于0.8%则呈下降趋势[22]。添加0.5%沙蒿籽胶可改善荞麦面包特性，添加超过1.3%时荞麦面包比容和感官评价下降[23]。沙蒿籽胶的最佳使用剂量可能与它的提取方法和纯度以及面粉特性有关。本研究结果表明，1.1%沙蒿籽胶与3.9 U/g木瓜蛋白酶复配添加能提升面筋网络结构强度，发酵时稳定容纳气体而提高比容，不影响色泽与口感，适用于馒头制品加工。

4 结论

本研究结果显示，通过木瓜蛋白酶适度水解，利用其对面筋蛋白中的醇溶蛋白较谷蛋白有更快的酶解速度，使表现高筋力的谷蛋白的相对占比提升，同时添加沙蒿籽胶以其高黏性和持水性从而增加面筋强度，两者共同作用增强面筋三维网络结构，因而能在高温焙烤时将酵母产生的CO2气体包裹住以减慢扩散速率，使馒头比容增大，效果优于偶氮甲酰胺。天然制剂的木瓜蛋白酶联合沙蒿籽胶能增强面团筋力，可作为常用增筋剂偶氮甲酰胺的优良替代品。