藏族药小叶棘豆药材质量标准研究△

夏梦棋，欧阳辉，吴宗耀，格桑顿珠，钟国跃，格桑次仁，杨世林，顿珠*，冯育林*

1.江西中医药大学 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006；

2.西藏藏医药大学，西藏 拉萨 850000

1 材料

1.1 试药

13 批小叶棘豆药材样品收集自西藏自治区，经江西中医药大学钟国跃教授鉴定为小叶棘豆Oxytropis microphylla（Pall.）DC.，样品来源及批号见表1；对照品2′,4′-二羟基查耳酮（批号：wkq21011101，纯度：97%，四川维克奇生物公司）；色谱纯乙腈、甲酸（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

表1 13批小叶棘豆来源信息

1.2 仪器与耗材

LC-20 AT 型高效液相色谱仪、AUW 220 D 型十万分之一电子天平（日本岛津公司）；COSMOSIL C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Nacalai Tesque 公司）；KQ-5200 DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CLA 00001142 C 型超纯水机（英国ELGA 公司）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；Reprostar 3 型薄层色谱摄像仪（瑞士卡玛公司）。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

本品多皱缩，碎断，长可达15 cm。根圆锥状，有分枝，表面黑褐色，质韧，断面纤维状。茎极短，丛生，基部残存密被白色绵毛的托叶。轮生羽状复叶，多破碎，完整者展开长5～15 cm；托叶卵状披针形，近革质，与叶柄基部合生，背面被稠密的白色绵毛，具腺点；叶柄与叶轴密被白色绵毛，具腺点；小叶多数轮生，每轮2～4（6）枚，小叶片长椭圆形或卵形，长3～5 mm，宽约2 mm，边缘内卷，上面疏被柔毛，两面密生腺点。气臭，味微苦、涩。小叶棘豆与来源于镰荚棘豆药材的性状差异主要在于后者为奇数羽状复叶，小叶呈镰状披针形，长7～12 mm[7]。

2.2 显微鉴别

按照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版（四部）显微鉴别法（通则2001）进行粉末制片，根据观察对象不同，滴加相应试液，盖片，显微镜下观察并拍照记录，见图1。

图1 小叶棘豆粉末显微图（×40）

灰白色粉末。非腺毛众多，长100～600 μm，茎15～46 μm，无色，双细胞，顶端锐尖，基部细胞短且壁较薄。导管多见，具螺纹和梯纹2 种，以梯纹导管为主，茎21～41 μm，纹孔呈窄缝。纤维少见，常碎断，茎10～41 μm，顶端尖，壁厚有少数单纹孔。

2.3 薄层色谱法（TLC）鉴别

取小叶棘豆药材粉末（过二号筛）1 g，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取小叶棘豆对照药材（批号：20200923）1 g，同法制成对照药材溶液。按照《中国药典》2020 年版通则0502，吸取上述2 种溶液各3 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图2。

图2 小叶棘豆药材TLC图

2.4 水分、浸出物、灰分测定

按照《中国药典》2020 年版通则0832 水分测定法第一法烘干法测定样品中水分，结果见表2。

以60%乙醇为溶剂，按照《中国药典》2020 年版通则2201 醇溶性浸出物测定法的热浸法测定样品中浸出物，结果见表2。

按照《中国药典》2020 年版通则2302 灰分测定法对样品中总灰分和酸不溶性灰分进行测定，结果见表2。

根据测定结果并结合《中国药典》2020 年版中药材的标准，水分、总灰分及酸不溶性灰分均以平均值的120%设限，浸出物以平均值的80%设限[20]，见表2。

表2 小叶棘豆药材检查项考察结果

2.5 高效液相色谱法（HPLC）含量测定

小叶棘豆含有黄酮类成分，研究表明，2′,4′-二羟查耳酮是其主要成分之一，具有抗炎镇痛活性[22-23]，故选择其作为含量测定的指标性成分。

2.5.1对照品溶液的制备 取2′,4′-二羟查耳酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.583 mg·mL-1的溶液。精密吸取上述溶液2 mL，加甲醇制成0.046 6 mg·mL-1的溶液，即得。

2.5.2供试品溶液的制备 取小叶棘豆（批号：20201120）药材粉末（过二号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理（100 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.3色谱条件 色谱柱为COSMOSIL C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸（A）-乙腈（B），等度洗脱（0.01～48.00 min，40%B；48～55 min，95%B；55～65 min，40%B）；流速为1 mL·min-1；检测波长为345 nm[22]；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

2.5.4方法学考察

2.5.4.1专属性试验 精密吸取空白溶液、2′,4′-二羟查耳酮对照品和供试品溶液注入色谱仪，并按2.5.3 项下色谱条件进行测试，理论板数不低于5000，色谱图见图3。小叶棘豆提取物中2′,4′-二羟查耳酮与相邻色谱峰的分离度＞1.5，说明该方法专属性良好。

图3 小叶棘豆样品、2′,4′-二羟查耳酮对照品HPLC图

2.5.4.2线性关系考察 将配制的2′,4′-二羟查耳酮对照品溶液按不同的倍数稀释，得到7 个不同质量浓度（0.009 3、0.023 3、0.037 3、0.046 6、0.069 9、0.093 3、0.139 9 μg·mL-1）的溶液。精密吸取上述7 份对照品溶液注入液相色谱仪，并以色谱峰面积和2′,4′-二羟查耳酮对照品质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性关系考察，其线性关系为Y=5×107X-44 171（r=1.000）。结果表明，2′,4′-二羟查耳酮在0.009 3～0.139 9 μg·mL-1质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5.4.3精密度试验 精密吸取2′,4′-二羟查耳酮对照品溶液，按2.5.3 项下色谱条件连续进样6 次，计算得到2′,4′-二羟查耳酮色谱峰面积的RSD 为0.57%，表明仪器精密度良好。

2.5.4.4重复性试验 取同一批（批号：20201120）样品，按2.5.2 项下方法制备供试品溶液，平行6份，并按2.5.3 项下色谱条件进行测试。小叶棘豆提取物中2′,4′-二羟查耳酮平均质量分数为1.17%，RSD为1.88%，说明该方法重复性较好。

2.5.4.5稳定性试验 取小叶棘豆（批号：20201120）供试品溶液，按2.5.3 项下色谱条件分别在0、2、4、6、10、17、24 h 进样测定，计算得到2′,4′-二羟查耳酮色谱峰面积的RSD 为0.47%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4.6加样回收率试验 取小叶棘豆（批号：20201120）供试品溶液6 份，分别精密加入相同体积的对照品（0.105 2 mg·mL-1），按2.5.2 项下方法制备供试品溶液，按2.5.3 项下色谱条件进样测定，计算平均加样回收率，2′,4′-二羟查耳酮平均回收率为100.49%，RSD为2.99%，具体结果见表3。

表3 小叶棘豆中2′,4′-二羟查耳酮加样回收率试验结果

2.6 样品含量测定

取13 批小叶棘豆样品，按2.5.2 项下方法制备样品溶液，按2.5.3 项下色谱条件进行测定，计算样品中2′,4′-二羟查耳酮成分的含量，结果见表4。结果表明，13 批小叶棘豆样品的2′,4′-二羟查耳酮质量分数为0.75%～1.72%，均值为1.34%，取均值的80%设限，其质量分数不得少于1.0%，13 批药材中有11 批合格，合格率为84.6%，故规定2′,4′-二羟查耳酮质量分数不得低于1.0%。

表4 13批小叶棘豆中2′,4′-二羟查耳酮质量分数 %

3 结果与讨论

本研究考察了13 批小叶棘豆浸出物、水分、总灰分、酸不溶性灰分含量，根据测定结果并结合《中国药典》2020 年版中药材的标准，建议规定小叶棘豆的醇溶性浸出物不得少于16%、水分不得超过7%、总灰分不得超过32%、酸不溶性灰分不得超过26%，以干燥品计算，2′,4′-二羟基查耳酮质量分数不得少于1.0%。

“莪大夏”为藏医临床常用特色药材，本课题组调查表明小叶棘豆O.microphylla为其主流商品之一（共收集“莪大夏”药材18 批，经基原鉴定，其中13 批为该种），而有关标准中并未收载该种。同时该种的资源较为丰富，具有利用的价值。本研究建立的方法准确度好、灵敏度较高，可为后续小叶棘豆药材质量标准的建立及质量控制提供参考。