五个印度芸豆品种总酚含量和抗氧化活性研究

Shwetha Narayanamoorthy，Harold Corke，李克虎

（1.上海交通大学 食品科学与工程系，上海 200240；2.贵州大学 生物技术系，贵州 贵阳 550025）

普通豆类（Phaseolus vulgaris）是全球生产最广泛、最突出的豆类作物之一，经济实惠的同时也是有益健康的营养来源，因此被称为“穷人的肉”[1]。根据其形态、基因型和位置，它们通常被称为不同的名称，如海军蓝豆、平豆、芸豆、法国豆、豆角等。芸豆是全球消费的最重要的普通豆类，因为它们含有高蛋白质含量（20%～25%）、复合碳水化合物（50%～60%）、矿物质，并且是维生素和多不饱和脂肪酸的重要来源[2]。印度是世界上最大的豆类生产国，种植豆类的土地面积约为1 543万hm2，总产量为639万t。芸豆在印度被普遍称为“Rajma”，主要是因为它们种植在喜马拉雅山脉西北部，后来也开始在其他地区种植。芸豆主要是利用其豆荚和种子的膳食成分，用于印度菜肴及其他亚洲国家的传统食品和墨西哥菜系，主要形式为主食、沙拉、罐头食品、烘焙食品[3]。

流行病学研究显示，食用芸豆与降低几种心血管疾病、II型糖尿病和某些癌症的风险之间存在正相关性[4]。芸豆的这些健康益处都归因于植物化学物质，其含有大量多酚化合物，其中许多被发现是有效的抗氧化剂，还具有抗炎、抗动脉粥样硬化和抗过敏活性。多酚的抗氧化性能是其通过螯合铜/铁等金属离子或作为供氢自由基清除剂抑制活性氧物种及其酶形成的能力的结果[5]。

尽管环境条件、提取方法、基因型等多种因素可以影响酚类物质的含量，但与子叶相比，普通豆类种皮中的酚类物质含量更高[6]。从植物和植物产品中获得的天然抗氧化剂具有很大的潜力，可以用作防腐剂，取代合成抗氧化剂。因此，探索和利用芸豆种皮中的抗氧化物，有助于开发芸豆的食品应用价值。

作为一项初步研究，旨在分析主要的5种广泛食用的印度芸豆（Rajma）品种的总酚含量和抗氧化活性。考虑到食用的安全性，用乙醇提取并进行了优化，而不是采用甲醇提取，因此这些提取物可以用于食品工业的进一步开发。研究的目的是发现印度本土的高抗氧化菜豆品种。研究结果可以为芸豆种皮的开发利用提供有价值的参考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

印度烹饪中常用的5种不同品种的芸豆，在印度称为Rajma（表1），购于马哈拉施特拉邦纳维孟买瓦希的APMC食品批发市场，其中包括黄棕色斑点芸豆（RB1）、棕红色长芸豆（RB2）、浅棕色斑点芸豆（RB3）、小黑芸豆（RB4）和小红芸豆（RB5）。

植物材料基本信息见表1。

表1 植物材料基本信息

1.2 化学品和试剂

使用的所有化学品和试剂均为分析级。2,2-二苯基-1-吡啶酰肼盐（DPPH）、福林-Cioc试剂（苯酚FCR）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基铬-2-羧酸（Trolox）、2,2'-叠氮（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、2,4,6-三（2-吡啶基）-s-三嗪（TPTZ）、没食子酸、儿茶素、无水氯化铁、七水硫酸亚铁、过硫酸钾、醋酸钠、碳酸钠、亚硝酸钠、氢氧化钠、盐酸、乙醇，HiMedia Laboratories Pvt.Ltd（孟买）提供；甲醇，SRL Chemicals Pvt Ltd.（孟买）提供。

1.3 豆皮提取物的制备和干燥

每种豆类品种150～170 g（取决于所需外壳粉的大小和数量）在水中浸泡8 h或更长时间，直到完全浸泡。然后剥下种皮并在40～50℃下烘箱干燥过夜，直到干燥。使用电机/混合器（Bajaj Rex 500）全速将干燥的种皮研磨成细粉，并在干燥器中进一步干燥数小时。将干豆皮粉末与80%乙醇以1∶10（W/V）的比例混合在50 mL锥形管中，锥形管小心地包裹在铝箔中以保护提取物免受光照，并以180 r/min的转速振荡混合24 h。然后将混合物以转速3 000 r/min离心15 min。收集上清液，使用Whatman过滤器4过滤，并在-20℃下储存，以便在4～5 d内用于分析（图1）。提取分3组进行。酚含量测定和抗氧化剂活性定量的计算以干重为基础。

5个品种种皮80%乙醇提取液见图1。

我国中小河流众多，由于人类活动的延伸，目前我国中小河流存在着退化以及山洪灾害日益加剧的态势，进行中小河流治理势在必行，但是，要从河流本身的自然规律出发，坚持生态水利建设，由传统水利向现代水利过渡，本着保持河流水体与河岸的连续性，保持河岸植物群落多样性，增进河流生态系统功能完善化，保持河岸带功能延伸化，延续河流的健康生命。

图1 5个品种种皮80%乙醇提取液

1.4 总酚

1.4.1 总酚含量（TPC）

将100μL适当稀释的样品（在80%乙醇中稀释40倍）添加到500μL 1∶10 W/V Folin-Ciocalteau（FC）试剂中，并在黑暗中培养4 min，对照品为80%乙醇。向这些溶液中添加400μL 75 g/L Na2CO3溶液，并在黑暗中培养2 h，随后于波长760 nm处测定溶液的吸光度。使用没食子酸制作标准曲线，质量浓度范围为0.02～0.12 mg/mL（R2=0.998）。结果以没食子酸当量（GAE）/g表示。每个样本重复测定3次。

1.4.2 总黄酮含量（TFC）

将700μL蒸馏水添加到100μL适当稀释的样品中。向这些混合物中添加0.5 mol/L NaNO2溶液30μL并在黑暗中培养6 min。添加0.3 mol/L AlCl3溶液30μL并培养6 min。最后，向试管中添加1 mol/L NaOH溶液200μL并培养15 min，然后于波长510 nm处测定吸光度。使用儿茶素制作标准曲线，质量浓度范围为0.05～0.25 mg/mL（R2=0.999）。结果以儿茶素当量表示，即CE/g。每个样本重复测定3次。

1.5 抗氧化活性

1.5.1 ABTS分析

将7.4 mmol/L ABTS与2.6 mmol/L过硫酸钾在蒸馏水中混合作为溶剂，并在黑暗中培养过夜（12～16 h）。将1 mL新制备的ABTS试剂与约50 mL 80%甲醇（1∶50 V/V）混合，使溶液的吸光度在734 nm处调整为0.70±0.02。将10μL适当稀释的样品添加到1 mL新鲜ABTS工作溶液中，并在室温下在黑暗中培养30 min。于波长734 nm处记录吸光度。使用浓度为0.3～1.5 mmol/L（R2=0.976）的Trolox标准品计算抑制百分比的标准曲线。对样品进行3次测定。

ABTS+自由基的清除率或抑制率通过以下公式计算：

式中：Abs对照——ABTS+·甲醇的吸光度，即试剂

Abs样品——种皮提取物的吸光度。抑制浓度（IC50）表示抑制反应混合物中生成的50%ABTS+自由基所需的提取物浓度。

1.5.2 DPPH分析

在80%甲醇中制备0.2 mmol/L DPPH自由基试剂，并在制备后立即使用。将100μL适当稀释的样品添加到900μL DPPH试剂中，并在黑暗中培养30 min，在波长517 nm处读取样品的吸光度。对提取物进行了3次试验。提取物对DPPH自由基的抑制百分比使用ABTS分析中所述的公式进行计算。使用浓度为0.1～0.5 mmol/L（R2=0.990）的Trolox标准品计算抑制百分比的标准曲线。对样品进行3次测定。

1.5.3 FRAP分析

以10∶1∶1的比例混合300 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH值3.6）、10 mmol/L TPTZ（2,4,6-三吡啶-s-三嗪）（以40 mmol/L HCl为溶剂）和20 mmol/L FeCl3溶液，以此制备FRAP试剂。将100μL适当稀释的样品添加到3 mL新制备的FRAP试剂中，并在室温下培养4 min。在波长593 nm处对试剂空白测定吸光度。该方法使用的标准溶液为FeSO4.7H2O溶液，浓度范围为0.2～1.0 mmol/L（R2=0.998）。结果以m mol Fe（II）/g表示。所有提取物进行3次测定。

1.6 统计分析

所有试验重复3次，结果以平均值±标准偏差（SD）表示。所有基本分析和图表均使用MS Excel（v16.0）。使用IBMSPSS对Duncan多范围检验后的值进行单向方差分析（ANOVA），以比较不同组之间的平均值。使用SPSS对测试参数进行Pearson相关分析。

2 结果和分析

总酚含量（TPC）表示为每克干质量种皮粉的没食子酸当量。试验获得的值范围为7～142 mg GAE/g，最高值为RB5，即红色小粒品种，最低值为黑色小粒品种。标记为RB1和RB3的黄棕色和浅棕色斑点豆为90～100 mg GAE/g时，也显示出相当高的TPC含量。以儿茶素当量表示的总黄酮含量（TFC）也有类似的趋势。RB 5的最高值为30 mg CE/g样品，其次是斑点RB1和RB3，分别为17和20 mg CE/g。RB2和RB4的均在10 mg CE/g左右（表2）。这些结果与前人的报道一致[7-8]。

FRAP分析最初由Benzie和Strain（1996）开发，用于测量血浆中的还原能力，但随后开始用于测定植物中的抗氧化剂。试验中，还原力最高的是RB5 1 171.78 mmol Fe（II）/g，其次是斑点品种RB3（679 mmol Fe（II）/g）、RB1 638 mmol Fe（II）/g和RB2 511.6 mmol Fe（II）/g，最小的是RB4 161.5 mmol Fe（II）/g（表2）。趋势几乎与TPC/TFC中观察到的趋势相似。

ABTS自由基溶于水和有机溶剂，不受离子强度的影响。因此，可以在多种介质中用于测定体液或样品提取物的亲脂性和亲水性抗氧化能力（Prior et al.，2005）。2,2-二苯基-1-吡啶酰肼（DPPH）自由基是一种稳定的有机氮自由基，呈深紫色。该分析主要基于电子转移反应和进一步的氢原子提取。这两种分析的基本概念是测量抗氧化剂对DPPH自由基的还原能力，通过测定吸光度的变化进行分析。ABTS和DPPH均以Trolox当量的mmol/g干粉表示。RB 5表现出最高的ABTS（1 897 mmol TE/g）和DPPH（1 191 mmol TE/g）值。斑点品种RB1和RB3分别在ABTS（1 076和1 251 mmol TE/g）和DPPH（1 105和1 022 mmol TE/g）测试中显示出非常高的抗氧化能力，但它们之间没有显著差异，这表明它们在抗自由基活性方面具有相似性（表2）。其次，RB2（ABTS，780 mmol TE/g；DPPH，806 mmol TE/g）和RB 4显示最低值（ABTS，462 mmol TE/g；DPPH，553 mmol TE/g），这与TPC/TFC中观察到的趋势一致。而相关性分析的结果也表明，抗氧化性指标两两间均存在显著的正相关（p＜0.01）（表3）。

5个印度芸豆品种的总酚含量及抗氧化力比较见表2，抗氧化性参数相关性分析结果见表3。

表2 5个印度芸豆品种的总酚含量及抗氧化力比较

表3 抗氧化性参数相关性分析结果

为了了解提取物对自由基的抑制程度，绘制了自由基抑制百分比图（图2、图3）。结果表明，RB5的自由基清除率为71%（ABTS）和88.8%（DPPH），在测试样品种最高。RB5的IC50（50%自由基抑制）值经计算得出约为17.6μLg/mL，而BHA（丁基羟基茴香醚）和BHT（丁基羟基甲苯）的IC50值分别为112μg/mL和202μg/mL。因此，RB5的IC50大约是食品工业中常用合成抗氧化剂的5倍。为了验证这一结果，还需要在不同的试验参数下与其他商用抗氧剂进行进一步的研究和对比分析。

ABTS抗氧化力及自由基清除率见图2，DPPH抗氧化力及自由基清除率见图3。

图2 ABTS抗氧化力及自由基清除率

图3 DPPH抗氧化力及自由基清除率

3 结论

研究分析的Rajma品种TPC、FRAP和ABTS的下降顺序为RB5＞RB3＞RB1＞RB2＞RB4（1和3之间无显著差异），TFC和DPPH的下降顺序为RB5＞RB1＞RB3＞RB2＞RB4。考虑到显著差异（表2），可以得出结论，RB 5，即小红芸豆的抗氧化性高，而RB 4（黑色小芸豆）表现出最低的抗氧化活性。如Pearson相关矩阵所示，TPC、TFC和所有抗氧化剂测定值之间存在显著的正相关（p＜0.01）。后续研究，可以以RB 5为试材，进一步评估其种皮提取物在食品着色剂、抗氧化剂配方和用于食品包装系的聚合物基薄膜中的应用。