宽胸理肺汤合三子养亲汤改善慢阻肺的实验研究

薛经纬 陶智会 李 勇 朱 毅

(1 上海市嘉定区中医医院内一科，上海,201800； 2 上海中医药大学附属第七人民医院全科，上海,200137； 3 上海市中医医院脾胃病科，上海,200071)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Diseases，COPD)是以不完全可逆的气流受限为主要特征，进行性加重、可治疗、可预防的呼吸系统常见疾病。由于COPD早期诊断较少，直至确诊时，患者病情严重，给患者生命质量、肺功能和心理状态均造成极大的危害。现阶段临床常采用的常规治疗措施以及药物，通常仅可以使症状得到改善，使急性加重的程度与次数得到缓解，却无法从根本上遏制肺功能的恶化，同时也出现了一些滥用激素以及抗生素的现象，引发了患者产生耐药性、免疫力下降、菌群构成失调以及严重的肠道不良反应等方面的问题。随着研究的不断深入，中医在COPD治疗方面已取得了明显的进展，相关研究表明，常规治疗与中医辨证深度融合可以使COPD患者的症状得到改善、急性加重次数下降、生命质量与运动耐力得到一定的提高。

目前，COPD的发病机制尚未完全明了。多数研究者认为气道和肺部的慢性炎症是导致COPD发生发展的主要机制，此外蛋白酶与抗蛋白酶系统、氧化与抗氧化作用以及自主神经系统等方面发生功能紊乱均在COPD进展中起重要作用[1]。最新研究发现，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)炎性小体是机体固有免疫的组分，它活化后参与了机体抵御外源性病原体的入侵[2-3]。目前研究已表明许多肺部的慢性炎症性疾病中都存在NLRP3炎性小体的激活，这些研究结果为继续探索COPD的发病机制及开发新药物及新的诊疗手段提供了一定的思路。

方邦江教授通过长期的临床实践认为痰浊壅肺证是COPD的主要证型之一，治疗上应以理肺、化痰、祛瘀立法，辨证论治，尽可能祛除外邪，改善症状，防止病情加重，使患者快速进入稳定期。故而创立了宽胸理肺汤，其由瓜蒌薤白半夏汤、二陈汤、三拗汤三方组成，临场疗效确切。而三子养亲汤是医治气滞痰壅的经典名方，具有镇咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。本课题组前期临床究结果表明，宽胸理肺汤合三子养亲汤治疗COPD患者，能有效抑制全身炎症反应,降低白细胞计数和中性粒细胞比例，降低血清炎症介质水平，改善肺功能，从而改善COPD急性加重期痰浊壅肺证患者的临床症状体征[4-5]。为进一步证实宽胸理肺汤合三子养亲汤的有效性及初步探讨其药理机制，本课题组拟采用烟熏诱导的大鼠COPD模型观察宽胸理肺汤合三子养亲汤对COPD大鼠肺组织的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性清洁级Wistar大鼠共42只，8周龄，体质量180～220 g，购自上海实验动物中心,生产许可SCXK(沪)2018-0004。清洁级动物房饲养，恒温(25±2)℃、恒湿，人工光照12 h，黑暗12 h，自由进食饮水。本研究经上海市中医医院动物实验伦理及福利委员会讨论、审查后同意进行动物实验(动物伦理审查号：SZY-2018-010-21)。

1.1.2 药物 实验药物及制备：处方组成：麻黄9 g、杏仁12 g、全瓜蒌30 g、薤白12 g、半夏10 g、橘红6 g、茯苓15 g、甘草6 g、桃仁10 g、地龙9 g、苏子10 g、莱菔子10 g、白芥子10 g。以上饮片由上海万仕诚药业有限公司提供。用自动煎药机煎煮成200 mL汤药，浓缩4倍，按实验所需浓度稀释。

1.1.3 试剂与仪器 主要试剂：NLRP3(Santa Cruz公司，美国，货号：sc-34410)、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein,ASP)抗体(Santa Cruz公司，美国，货号：sc-514414)、胱天蛋白酶1抗体(Abcam公司，美国，货号：ab179515)、辣根酶标记山羊抗鼠、兔IgG(Cell Signaling Technology公司，美国，货号：7076/7074)、β-actin抗体(Cell Signaling Technology公司，美国，货号：3700)，白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-18酶联免疫吸附试验试剂盒(上海西唐生物科技有限公司，货号：F15810，F15950)，腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)、JC-1检测试剂盒(碧云天生物科技有限公司，货号：S0026，C2006)，MitoSOX Red探针(Thermo公司，美国，货号：M36008)；脂多糖(Sigma公司，美国，货号：L8274)。台式高速冷冻离心机(Heal force公司，型号：Neofuge 15R)，荧光酶标仪(Thermo scientific公司，美国，型号：Var10skan Flash)，洗板机(Labsystems dragon公司，芬兰，型号：Wellwash 4mk2)，电动匀浆机(上海净信公司，型号：JX-FSTPRP-48)，微型垂直电泳、电转移系统(Bio-rad公司，美国，型号：Mini-PROTEAN)，全自动显影系统(Bio-rad公司，美国，型号：ChemiDocTMXRS+)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 实验动物按体质量进行随机分组，共6组，每组7只，分组如下：宽胸理肺汤合三子养亲汤低、中、高剂量组，模型组，阳性对照药乙酰半胱氨酸组(NAC组)和对照组。COPD模型制作[6]：采用烟熏加气管滴注脂多糖法制备COPD大鼠模型。对照组大鼠每天正常呼吸新鲜空气，模型组大鼠在染毒箱内被动吸烟每天12支/次，染毒时间为30 min，其余时间呼吸新鲜空气。并且在第1天及第14天时，将模型组大鼠进行麻醉后在气管内滴注200 μL脂多糖水溶液(1 mg/mL)，滴注过程需缓慢，对照组使用相同体积的0.9%生理盐水进行气管滴注，滴注日不进行染毒操作。连续烟熏28 d后，验证模型制备成功。

1.2.2 给药方法 中药高、中、低剂量组分别按照5、2.5、1.25 g生药/kg的药物剂量，为临床用药的2、1、0.5倍，乙酰半胱氨酸组的给药剂量为0.8 g/kg，为临床用药的1倍，药物均用0.5%羧甲基纤维素钠配制。

模型组和对照组分别灌服0.5%羧甲基纤维素钠。每组药物按照10 mL/kg的体积，1次/d，持续给药28 d。

1.2.3 检测指标与方法 各组大鼠在末次给药后24 h，分别用10 mg/mL浓度的戊巴比妥纳进行麻醉，随后解剖开胸经心脏采集血液，并在常温下，以3 500×g的速度进行离心操作，离心10 min后将血清抽取存放至EP管中，随后保存在-20 ℃冰箱以备后续检测，并且将一部分大鼠肺组织放置于4%多聚甲醛进行组织固定，以备制作病理切片，另取用锡纸将一部分肺组织包裹后放-80 ℃冰箱保存以备后续蛋白检测，另一部分则快速进行线粒体抽取及相关检测工作。蛋白质印迹法检测按参考文献[7]操作，将适量大鼠加入放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay，RIPA)裂解缓冲液，随后组织匀浆、超声裂解、低温高速离心、抽取上清等操作步骤提取组织蛋白。并经过二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法蛋白定量后按调定的蛋白比例加入5×上样缓冲液，煮沸变性待测。将蛋白样本经凝胶电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜上。随后经封闭、洗涤、一抗孵育(2%牛血清白蛋白稀释至1∶500～1∶1 000)、洗涤、二抗孵育(5%脱脂奶粉稀释至1∶1 000～1∶2 000)、洗涤、显影等步骤，最后使用ChemiDocTMXRS+凝胶成像分析系统进行蛋白半定量分析，用目的蛋白/内参蛋白的光密度值比率来表示目的蛋白的相对表达量。酶联免疫吸附试验检测操作按试剂盒说明书进行。

线粒体膜电位、ATP、活性氧的测定[8]：1)按试剂盒步骤提取肺组织的线粒体；2)肺组织线粒体膜电位检测：将提取的线粒体质量悬后按说明书要求的比例加入稀释后的JC-1工作液。用荧光酶标仪进行检测，检测JC-1单体、JC-1聚合物分别按照490 nm/530 nm(绿光)及525 nm/590 nm(红光)波长设置激发光和发射光；红/绿的结果代表线粒体膜电位值；3)肺组织线粒体ATP的检测：将提取的线粒体用ATP裂解液分解后离心提取上清液待检，ATP检测工作液与样本按100/5 μL比例进行加样，混合2 s以上上机检测，ATP的浓度要参照标准曲线进行计算。最后用BCA法定量蛋白，将ATP浓度单位换算成μmol/mg。4)将分离的线粒体悬于40 μL的线粒体贮存液中。在黑色96孔板中毎孔加300 μL MitoSOX探针工作液及10 μL重悬的线粒体，随后37 ℃避光孵育30 min，用含钙镁的汉斯缓冲盐溶液洗涤3次后加入适量缓冲液，用荧光酶标仪检测，将激发光与发射光分别设置510 nm及580 nm波长。用BCA法定量蛋白，将活性氧含量换算成荧光强度rfu/mg。

2 结果

2.1 肺组织线粒体损伤情况变化 与对照组比较，模型组大鼠肺组织线粒体ATP合成量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，线粒体膜电位水平有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，活性氧生成显著增加。宽胸理肺汤合三子养亲汤呈剂量依赖性升高COPD大鼠肺组织线粒体ATP合成量，降低活性氧生成(P<0.01)，但对线粒体膜电位无显著作用。阳性对照药物NAC也可显著升高COPD大鼠肺组织线粒体ATP合成量，降低活性氧生成(P<0.01)。见表1。

表1 宽胸理肺汤合三子养亲汤对COPD大鼠线粒体功能的影响

2.2 肺组织NLRP3炎性小体表达变化 COPD大鼠NLRP3、凋亡相关斑样蛋白、胱天蛋白酶1-p10蛋白表达显著上升，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。宽胸理肺汤合三子养亲汤各剂量及NAC干预后，COPD大鼠的NLRP3炎性小体各蛋白表达呈显著下降趋势(P<0.05)。见图1。

图1 宽胸理肺汤合三子养亲汤对COPD大鼠NLRP3炎性小体的影响

2.3 肺组织炎症介质IL-1β、IL-18变化 酶联免疫吸附试验检测发现COPD大鼠IL-1β、IL-18含量显著高于对照组(P<0.05)。宽胸理肺汤合三子养亲汤各剂量及NAC干预后，均可使COPD大鼠IL-1β、IL-18含量显著降低(P<0.05)。见图2。

图2 宽胸理肺汤合三子养亲汤对COPD大鼠肺组织IL-1β、IL-18含量的影响

3 讨论

COPD属于一种可防可治、常见的疾病，该病的主要表现是气流受限与呼吸道症状，其导致原因是气道和(或)肺泡异常，常由于长期暴露于有害颗粒或气体所引发。本病以咳嗽、咳痰、呼吸困难为主要临床表现，同时具有病情迁延不愈、症状常年存在或者疾病反复发作性，具有病程长、易复发等特征[9]。据世界卫生组织统计,全球约有6 500万患者罹患中重度COPD；中国COPD总体发病率为8.6%，40岁以上人群发病率高达13.7%，以此估算我国COPD患者可达到9 990万，已成为与高血压、糖尿病“等量齐观”的慢性疾病[10]。2017年世界范围内有391.4万人死于慢性呼吸道类疾病，而有319.7万人死于COPD[11-12]。虽然目前治疗COPD的手段可以在一定程度上使患者的临床症状得到缓解，提高患者的生命质量，不过却无法有效抑制病情的发展，所以，对COPD的发病机制进行深入探索，研究出更有效的治疗措施具有一定的临床意义。

COPD具有极为复杂的发病机制，目前尚未完全阐明。现代医学对COPD的发病机制作了广泛而深入的研究，提出了多种不同的假说，比如细胞凋亡、蛋白酶失衡、炎症机制以及抗氧化失衡机制等，此外也有一些学者提出了无效受损修复、微生物组变化与自身免疫反应等机制[13]。上述假说的提出丰富了人类对COPD的认知，为相关研究的开展与深入提供了理论依据。COPD的特征是不完全可逆气流受限，一般会伴有有害气体或是颗粒的炎症反应[14]，就本质来讲，COPD属于一种气道的炎症。NLRP3炎性小体是由NLRP3、凋亡相关斑样蛋白和胱天蛋白酶-1所组成的一个多聚体蛋白复合物。活化的NLRP3炎性小体可使无活性的原胱天蛋白酶-1切割成具有活性的胱天蛋白酶-1片段，而后者可将原白细胞介素-1β和原白细胞介素-18裂解为成熟白细胞介素-1β和白细胞介素-18并分泌到细胞外发挥活性效应，启动炎症级联反应。目前已有研究证实，线粒体活性氧是NLRP3炎性小体活化的关键上游效应因子[15-16]。而NLRP3炎性小体在COPD的发生、发展中起着重要作用。引起COPD的众多病因(包括吸烟、感染、化学物质、职业粉尘、空气污染等)都可引起肺组织的氧化应激增加，使NLRP3炎性小体过量激活，导致肺部慢性炎症持续存在，引发肺气肿和小气道重塑及纤维化，从而导致气体陷闭和气流受限，继而出现呼吸困难等症状。而动物实验结果表明，抑制NLRP3炎性小体的上游激活物，或阻断其下游效应分子能够有效地减缓COPD的发生发展[17-20]。综上所述，通过开发抑制NLRP3炎性小体及其下游效应分子的药物，可能是缓解COPD进程，提高患者生命质量和生存率的一种新的药物研究策略。

COPD在中医学中并无专属病名，根据其临床表现、相关症状体征及病情进展状态，大部分医家将其辨病为“咳嗽”“喘证”“肺胀”等病。COPD临床表现多是由肺部疾病日久迁延不愈所致，故“肺胀”病名与其契合度最高。目前大多医家认为肺胀病因病机在于先有肺虚，之后邪实闭肺而喘,为本虚标实之病，也提示本病的形成和发展，不但与正虚相关,而且和外邪的反复侵袭有关，由于外邪入里而产生内外合邪，形成正虚邪恋,最终导致病情加重。此外在COPD发展的不同阶段，病机特点有所侧重，早期以肺虚为主，病情进一步发展,久病累及他脏，使患者脾与肾也受到影响，COPD不断反复的关键内因为肺脾肾虚。COPD病位在肺，但其发生、发展与转归与肺、脾、肾三脏密切相关。普遍认为本虚标实是COPD的基本病机，本虚多涉及肺脾肾等脏腑，标实多与痰、瘀、六淫外邪等有关。宽胸理肺汤是方邦江教授以瓜蒌薤白半夏汤合二陈汤、三拗汤化裁而成，宽胸理肺汤可以有效地治疗痰浊壅肺型COPD，宽胸理肺汤由瓜蒌薤白半夏汤、二陈汤、三拗汤三方化裁而成，瓜蒌薤白半夏汤可以通阳散结，行气解郁，化痰宽胸，此处用其涤痰行水之功，对于痰湿水饮壅滞于肺脏，肺气失于宣降所导致的咳嗽咳痰，气促的症状有较好的疗效，二陈汤燥湿化痰，三拗汤止咳平喘，三方合用，共同起到化痰平喘，行气解瘀的功效。三子养亲汤是医治气滞痰壅的经典名方，具有镇咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。本课题组前期临床究结果表明，宽胸理肺汤合三子养亲汤治疗COPD患者，能有效抑制全身炎症反应,降低白细胞计数和中性粒细胞比例，降低血清炎症介质水平，改善肺功能，从而改善COPD急性加重期痰浊壅肺证患者的临床症状体征，但其作用机制尚不明确。本研究发现宽胸理肺汤合三子养亲汤能够显著改善COPD大鼠肺组织线粒体功能，具体体现在提高肺组织线粒体ATP合成量，减少线粒体损伤引起的活性氧释放等，并且能够抑制线粒体活性氧下游NLRP3炎性小体的活化。

综上所述，宽胸理肺汤合三子养亲汤可能通过抑制线粒体活性氧-NLRP3信号通路抑制COPD的发生发展。本研究不仅对COPD的西医学机制作出创新性研究，并且为中药验方宽胸理肺汤合三子养亲汤的临床疗效提供了现代分子生物学的基础，为其临床推广提供了一定的实验依据。