富营养河口水体藻华粒级结构的调控机制研究

张亚锋 ，侯敏驰，陈容，王适，雷越，王旭涛 *，殷克东*

( 1.中山大学 海洋科学学院/南方海洋科学与工程广东省实验室（珠海），广东 珠海 519082；2.生态环境部珠江流域南海海域生态环境监督管理局 生态环境监测与科学研究中心，广东 广州 510611)

1 引言

藻类通过光合作用将二氧化碳和无机营养盐转化成有机物，是海洋生态系统中的初级生产者，藻类被浮游动物摄食，而浮游动物会被更高营养级的游泳动物摄食，它们共同构成了海洋食物链[1-2]。小型浮游动物（粒级小于200 μm）摄食对藻类群落会产生影响，但小型浮游动物对不同粒级藻类摄食的偏好理论存在争议[3-5]。有研究发现小型浮游动物对较小的藻类有更高的摄食速率[6]，也有研究发现相反现象[7-8]，还有研究发现这种粒级偏好并不明显[9-10]。因此，小型浮游动物是优先选择大细胞的藻类以便完成有效摄食，还是选择生长较快的小细胞藻类以保证食物供给，仍需进一步研究[5,11-12]。

目前，虽有藻华期间藻类生长和小型浮游动物摄食的实地测量数据[12-14]，但是在藻华的不同阶段同时监测藻类生长和小型浮游动物摄食的数据仍然不足。在藻华不同阶段，关于小型浮游动物和藻类关系的研究主要有两种途径：其一，同一时期不同站位测定小型浮游动物的摄食速率和藻类的生长速率，然后根据水体中藻类的初始浓度来确定藻华的不同阶段[7,12]；其二，在同一采样站点连续几周或几月跟踪监测藻华过程中浮游生物之间的关系[10,15-16]。前者的空间尺度大，浮游生物的组成受环境影响较大，后者由于在较长的时间范围内不连续采样，容易错过藻华发生的不同阶段。因此，这两种方法都具有一定局限性。

河口水体中藻华暴发的范围和持续时间受温度、光照、营养和浮游动物的摄食等多种因素的影响[16-18]。珠江是中国径流量第二大河流，较大的盐度、浊度和营养盐浓度等条件梯度使得珠江口水域的浮游生物处于复杂的生长环境[19-21]，人类活动引发的珠江口水体富营养化已经造成藻华和赤潮频发[22-24]。目前包括营养盐、光照、风力和其他物理作用对浮游生物的聚集效应在内的环境因素对珠江口水域藻华形成机制的研究已经相对比较充分[25-27]。然而，在珠江口水域暴发藻华的过程中，小型浮游动物摄食活动对藻类群落结构的影响相对较小[9-10]，缺乏营养盐和小型浮游动物摄食活动对藻华粒级结构影响的同步研究。由于实地研究很难消除光照、风力混合等环境因素的作用，而河口水体盐度受潮汐周期影响显著，因此，为了对比珠江口不同区域水体中上行控制（营养盐刺激）和下行控制（小型浮游动物摄食）对藻华粒级结构的调控，本研究利用珠江口枯水期3类盐度水体进行室内培养实验，并同时利用分级稀释法估算藻类的生长速率和小型浮游动物的摄食速率，探究不同盐度水体中：（1）营养盐对藻类生物量和粒级的影响；（2）小型浮游动物摄食活动的粒级偏好；（3）对比上行控制（营养刺激）和下行控制（浮游动物摄食）对藻华粒级结构的影响。

2 材料与方法

2.1 采样和实验设计

藻华是指水体中浮游生物在短时间内暴发性增殖或聚集而使水体变色的现象，本文主要研究藻类在短时间内暴发性增殖这一过程。于2015年12月在珠江口水域上游水深 为 4 m 的站点（22°49′16′′N，113°34′00′′E；盐度为 2.86）和下游水深为 15 m 的站点（22°00′34′′N，113°53′13′′E；盐度为 31.71）采集表层0.5 m处的水样，所有采集到的水样现场用孔径为200 μm的筛绢过滤除去中大型浮游动物，当天运回实验室进行实验。通过等比例混合低盐度河水和高盐度海水制成中盐度的水样（盐度为17.25），把3类盐度水样分别分成两部分，一部分添加营养盐（额外添加的营养盐终浓度约为 NO3-N 100 μmol/L、PO4-P 6 μmol/L ），另一部分不做处理，作为对照组。将6组水样分别分装在容量为2.8 L的聚碳酸酯瓶内（共60瓶），每瓶装水样2.5 L，放在恒温25℃（采样点当天实地最高温度为 23℃）、光强恒定为 500 μmoL/（m2·s）的培养室内，进行24 h光照培养，每天摇匀培养瓶2～3次，采样前再次充分摇匀，实验进行5 d。培养开始前分别收集叶绿素和营养盐样品，培养期间每组样品每天13：00消耗2个培养瓶进行叶绿素和营养盐样品收集并进行稀释培养实验。

取300～500 mL水样，依次通过孔径为20 μm、2.0 μm 和 0.2 μm 的滤膜，滤膜用锡纸包好放在−20℃冰箱保存，用来测定粒级在 20～200 μm（小型）、2～20 μm（微型）和 0.2～2 μm（超微型）的叶绿素。取过滤后的水样50 mL到营养盐瓶，然后将其迅速放到−20℃冰箱中冷冻保存。实验用到的所有容器都提前用10%的盐酸浸泡，超纯水清洗过后烘干，并在实验时用水样润洗。

连续5 d利用营养加富组水样进行稀释实验，以测定小型浮游动物摄食速率和藻类生长速率[28]，本研究用第1天水体的稀释实验结果作为小型浮游动物摄食速率和藻类生长速率的初始值。利用通过0.2 μm的滤膜过滤的无藻类水稀释正常水样，稀释梯度为0.25、0.5、0.75、1.0。将处理好的水样分装在250 mL的聚碳酸酯培养瓶中，添加终浓度分别为0.5 μmol/L NH4Cl、0.03 μmol/L KH2PO4、1 nmol/L FeCl3和0.1 nmol/L MnCl2的营养盐[29]，另外3个不添加营养盐的平行样为对照组。所有培养瓶放在培养室内培养24 h，培养室温度和光照强度分别为 25℃ 和 500 μmol/（m2·s）。在培养开始和结束时，分别用孔径为20 μm、2.0 μm和0.2 μm的滤膜过滤，以收集不同粒级的叶绿素样品。

叶绿素a用丙酮萃取法测定[30]。将叶绿素滤膜置于含有10 mL 90%的丙酮溶液中，在4°C黑暗条件下萃取14～16 h。离心后取上清液用荧光光度计（10-AU Turner Designs© fluorometer, 美国）测定吸光值，计算叶绿素a浓度。无机营养盐（铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐和磷酸盐）浓度用营养盐自动分析仪（Futura, Alliance Instrument, 法国）进行测定。

2.2 数据分析和计算

根据藻类指数生长模型，本研究利用叶绿素a浓度估算藻类每天的比生长速率μChla=[ln(Pt/P0)]/t，其中t是培养时间，P0和Pt分别是培养前后叶绿素a的浓度。利用2.8 L培养瓶中叶绿素a浓度的每日变化，计算了实验期间藻类群落每日的比生长速率。在稀释实验中，利用μChla在不同稀释梯度上进行线性回归，回归方程的截距为藻类生长速率μ，斜率的相反数为浮游动物的摄食速率m，藻类被小型浮游动物摄食率为m/μ。本研究中利用2.8 L培养瓶计算的每日比生长速率μChla更接近实验期间藻类群落每日的净生长速率，利用稀释法估算的藻类生长速率μ为藻类群落的内禀生长率[31]。

所有数据利用OriginPro 2021进行统计分析。用ANOVA方法来分析藻类生长速率（μ），小型浮游动物摄食速率（m）和藻类每日比生长速率（μChla）之间的相关性。当p＜0.05时，数据具有统计学意义。

3 结果

在不同盐度梯度的自然水体中，叶绿素a的浓度随着培养时间都表现出先增加后降低的趋势，且其最大值随盐度升高而降低（图1a，图1c和图1e）。营养加富能增加叶绿素a浓度的最大值，但增量随着初始水体的营养水平增加而减弱（图1b，图1d和图1f）。另外，叶绿素a浓度快速增殖的持续时间随着营养盐的加入明显延长，特别是在高盐度海水中。培养结束时，自然水体中的藻华已开始消亡，而加富河水中藻类进入稳定期（图1f），加富混合和加富海水中的藻类仍然处于快速生长期（图1d，图1b）。培养前后藻类粒级结构均发生了变化，从超微型和微型藻类主导（占比大于85%），变成了小型藻类主导（占比大于50%）。叶绿素a浓度的变化与营养盐（TIN, P）浓度的变化相一致（表1），自然水体中营养盐浓度较低，藻类将水体中的营养盐消耗完后藻华开始消亡；营养加富后，3类盐度水体中营养盐在培养结束时依然充足，藻类生长未进入衰亡期。

表1 培养实验中自然和营养加富的河水、混合水和海水的总无机氮（TIN）、磷酸盐（P）的浓度变化（平均值±标准偏差，单位：μmol/kg）Table 1 The concentrations (mean±SD, unit: μmol/kg) of total inorganic nitrogen (TIN) and phosphate (P) during the incubation in natural and nutrient added river water, mixed water and sea water

图1 自然和营养加富的海水、混合水和河水中3种粒级叶绿素a的浓度Fig.1 Concentrations of three size fractionation chlorophyll a in natural and nutrient added sea water, mixed water and river water

不同盐度水体中藻类群落每日的比生长速率变化如图2所示，自然水体中藻类群落的净生长大体上只持续了 2 d（μChla＞0）（图2a，图2c和图2e）；而在营养加富的实验组，藻类大体上保持净生长，但生长速率逐渐降低（图2b，图2d和图2f），小型藻类的净生长速率第3天和第4天在整个群落中占比较大，但因为初始浓度较低，在培养3 d后成为藻华优势种。总体而言，在藻类暴发性增殖过程中，大粒级藻类逐渐成为优势种，而且营养加富能加大其优势。

图2 培养实验中自然和营养加富的海水、混合水和河水中3种粒级藻类每日的比生长速率（μChl a）Fig.2 Daily algal specific growth rates (μChl a) for three size fractionation phytoplankton during the incubation in natural and nutrient added sea water, mixed water and river water

3类盐度的加富水体中，m具有相似的变化趋势，以第1天作为参考值，总摄食速率在第2天或第3天达到最大值后开始下降（图3a，图3b和图3c）。总体而言，海水中的平均m（（0.68±0.19）d−1）大于混合水（（0.45±0.17）d−1）和河水（（0.51±0.18）d−1）。μ在 3 个实验组的变化不同（图3d，图3e和图3f）：藻类总生长速率在海水中保持增长，在混合水中先增加后减少，在河水中大体呈降低趋势。总体而言，μ在海水中（（1.06±0.16）d−1）明显高于混合水（（0.58±0.14）d−1），在河水中波动较大（（1.13±0.37）d−1）。不同粒级μ和m具有一致性（图3a至图3f）：海水中，小型藻类μ高于微型和超微型，小型浮游动物对小型藻类的摄食率在培养的前3天也较高（图3a，图3d）；混合水中，μ和m均在第2天达到最大值（图3b，图3e）；河水中，超微型浮游动物μ和它面临摄食压力的初始值都较高，而小型浮游动物μ和m都在第3天达到最大值（图3c，图3f）。

图3 培养实验中营养加富的海水、混合水和河水中3种粒级藻类和总体的生长速率（μ）、小型浮游动物的摄食速率（m）以及藻类被小型浮游动物的摄食率（m/μ）Fig.3 Microzooplankton grazing rates (m), algal growth rates (μ) and the consumption ratios of phytoplankton by microzooplankton (m/μ) for three size fractionation phytoplankton and total phytoplankton during the incubation in nutrient added sea water, mixed water and river water

3组加富实验组中藻类被小型浮游动物的摄食率（m/µ）表现出两个趋势（图3g至图3i）：中、高盐度水体中，初始m/μ较高（＞0.5），m/μ在前 3 天逐渐增加，然后降低（图3g，图3h）；在低盐度河水中，初始m/μ较低（＜0.5），m/μ逐渐增加，在培养结束时达到1.0上下（图3i）。总体而言，不同粒级的m/μ变化趋势和整体的m/μ的变化趋势一致，但超微型粒级的m/μ在 3个粒级中一直最高，当m/μ＞1时，意味着所有的超微型藻类都被小型浮游动物摄食消耗。

4 讨论

4.1 上行控制对藻华的影响

藻类生长大量消耗水体中的营养盐，当营养盐消耗殆尽时，藻类的生长速率开始下降；当浮游动物的摄食速率大于藻类的生长速率时，藻华开始崩溃消亡[16,32-33]。在本研究中，自然水体中营养盐的初始浓度从海水到河水逐渐增加（表1），藻类暴发性增殖的持续时间从海水中的2 d增加到河水中的4 d，而培养结束时加富水体中依然有充足的营养盐，藻类仍然处于暴发性增殖，这说明藻类暴发性增殖的生物量和营养盐水平直接相关。另外，营养盐水平同样影响藻类群落的粒级结构，长期的进化过程中，小粒级藻类在获得营养方面具有竞争优势[31,34]，这是培养开始时营养盐浓度较低的自然水体中微型和超微型藻类是优势种的原因；而在营养盐充足且生长条件适宜的情况下，大粒级藻类具有更大的生长潜能[34-35]，这可能是小型藻类逐渐成为优势粒级的原因。因此，营养盐是驱动藻类暴发性生长的主要因素，上行刺激决定了藻类群落生物量的上限，并影响藻类的粒级结构。

4.2 下行控制对藻华的影响

研究发现，藻类生长越快，面临的摄食压力也越大[1,12]，本研究同样发现小型浮游动物的摄食速率与藻类生长速率显著正相关（图4）。藻华暴发“空窗期”理论认为，藻华优势种能利用某些综合机制（比如细胞个体大）逃脱浮游动物的摄食，进而主导藻华的暴发[36]。根据“空窗期”暴发理论，加富水体中小型藻类成为藻华优势种是因为小型藻类能逃脱小型浮游动物的摄食，或者说小型浮游动物对小型藻类摄食速率较低，然而除在海水组前3天外，小型浮游动物对不同粒级藻类的摄食速率并没有明显差异（图3）。在全球小型浮游动物摄食速率的统计数据中，在藻类粒级结构不同的水体中，不同粒级的藻类面临的被摄食速率基本处在同一水平[37-38]。因此，珠江口小型浮游动物摄食本身没有粒级偏好性。

图4 在营养加富的海水、混合水和河水中小型浮游动物的摄食速率（m）和藻类的生长速率（μ）关系Fig.4 Relationships between microzooplankton grazing rates(m) and algal growth rates (μ) in nutrient added sea water,mixed water and river water

4.3 藻华粒级结构的调控机制

上行控制对不同粒级藻类生长的刺激不同，下行控制没有粒级选择性，但不同粒级m/μ具有较大差异。3类盐度加富水体中微型和超微型藻类的平均m/μ都大于小型藻类的，其中超微型和小型藻类m/μ存在显著性差异（图5A），说明虽然小型浮游动物对不同粒级藻类的摄食速率差异不大，但不同粒级藻类生产速率的差异造成了其面临的摄食压力（m/μ）并不相同。在寡营养水体，浮游动物摄食释放的营养盐是藻类生长所需营养盐的主要来源，营养盐浓度的波动使得某些机会主义藻种迅速生长，成为藻华的优势种[12,35]；而在富营养水体中，由于小型藻类在营养盐充足的条件下具有更大的生长速率，其面临的摄食压力更小，所以更容易打破下行控制，成为藻华暴发的优势种，这解释了加富水体中藻类群落如何由初始小粒级主导转变为大粒级主导（图5B）。之前研究同样表明藻华演化受m/μ调控[12]，在营养丰富的藻华前期，m＜μ；在营养消耗完的藻华中后期，m≥μ。本研究中藻类μChla和m/μ具有显著的负相关性（图6），这说明随着营养盐的消耗，藻类生长速率减弱，同时造成m/μ升高，营养盐刺激的减弱使得下行控制对藻类群落的控制作用加强。因此，河口富营养水体中藻类粒级结构受营养盐刺激上行控制和小型浮游动物摄食下行控制共同调控，但在藻华暴发和消亡的短时间内小型浮游动物摄食变化并不明显，影响藻华粒级结构的主要因素是营养盐刺激的上行控制。

图5 在营养加富的海水、混合水和河水中3种粒级的藻类被小型浮游动物摄食率（m/μ）（A）及3种粒级藻类叶绿素a浓度在培养初始和结束时各自占比（B）Fig.5 Ratios of three size fractionation phytoplankton consumed by microzooplankton (m/μ) (A) and percentages of three size fractionation Chl a concentration to total Chl a concentration in the initial and end incubation (B) in the nutrient added sea water, mixed water and river water

图6 在营养加富的海水、混合水和河水中藻类的比生长速率（μChl a）和其被小型浮游动物摄食率（m/μ）的关系Fig.6 Relationships between algal specific growth rates (μChl a)and their ratios consumed by microzooplankton (m/μ) in the nutrient added sea water, mixed water and river water

5 结论

不同于寡营养大洋水体中藻类生物量受小型浮游动物摄食活动严格控制，河口富营养水体中丰富的营养盐促使藻类暴发性生长，而短时间内小型浮游动物的摄食速率并没有增加，进而降低了藻类群落面临的摄食压力，形成高生物量的藻华。在富营养条件下，大粒级藻类具有更大的生长速率，使得其面临的摄食压力较小，而小粒级藻类则面临较大的摄食压力，这共同导致了富营养河口水体形成大粒级主导的藻华。由于本研究中实验水样取自珠江口枯水期，与丰水期水体中营养盐浓度、藻类种类及丰度具有较大不同；另外本研究利用叶绿素a浓度来表征生物量并计算藻类生长速率，没有考虑不同盐度水体中藻类叶绿素a浓度的种间差异，这些因素的影响都需进一步研究。