响应面法优化赤芝、紫芝子实体总三萜提取工艺

李思雨，张 静，崔馨戈，祝朋玲，袁抒捷，王 雯，周 俊，彭 灿，3，4,5,6

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽黄山云乐灵芝有限公司，安徽 宣城 242600; 3. 中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；4. 安徽省中医药研究院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012;5. 药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012; 6.省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥 230012)

灵芝作为中国珍贵的药食同源类中药材，是“十大皖药”之一，始载于《神农本草经》，《中华人民共和国药典》记载其为赤芝Ganodermalucidum(Leyss.exFr.) Karst.、紫芝GanodermasinenseZhao, Xu et Zhang的干燥子实体。中医以阴阳五行学说将灵芝分为五芝，其中赤芝主治胸中结，可益心气、补中，增慧智，令人不忘；紫芝主治耳聋，可利关节、保神、益精气、坚筋骨、养容颜。现代研究表明，赤芝对心脑血管疾病[1-2]引起的心悸、心律不齐等效果较好，紫芝有调节免疫功能[3-5]、抑制细菌[6-7]、治疗骨损伤[8]等作用。

灵芝所含有的化学成分多样，其中三萜类化合物作为灵芝的主要活性成分之一，具有多种药理作用[9-12]。既往研究[13]表明，赤芝与紫芝之间的三萜类成分存在差异，应基于品种特点建立一种高效简便的灵芝三萜提取方法。目前，用于提取灵芝中三萜的方法有索氏回流提取、超临界CO2提取、亚临界水提取、超声波提取等[14]，其中超声波法在中草药提取方面具有优越性，不仅超声时间短，还可加速灵芝中三萜成分的释放，而且操作简便，溶剂消耗低。

基于此，本研究旨在优化赤芝、紫芝子实体中总三萜超声提取工艺，为系统研究赤芝、紫芝成分差异及后续产品开发奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 BT25S十万分之一分析天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；DF-101T集热式恒温加热磁力搅拌器、SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵：河南省予华仪器有限公司；UV-1900型紫外-可见分光光度计：上海元析分析仪器有限公司； YL-060S型超声波清洗机：山东省济南巴克超声波科技有限公司。

1.2 试剂 赤芝、紫芝子实体(经安徽中医药大学杨青山副教授鉴定为多孔菌科赤芝Ganodermalucidum、紫芝Ganodermasinense子实体)：安徽省旌德县安徽黄山云乐灵芝有限公司；无水甲醇(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、冰醋酸(分析纯)、香草醛(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)：上海润捷化学试剂有限公司；高氯酸(优级纯)：国药集团化学试剂有限公司；齐墩果酸对照品(色谱纯，纯度≥98%，批号 CHB171229)：成都克洛玛生物科技有限公司。

2 方法

2.1 齐墩果酸标准曲线的绘制及灵芝子实体总三萜的提取

2.1.1 标准曲线的绘制 精密称定齐墩果酸对照品适量，加甲醇配制成0.2 mg/mL的对照品溶液，备用。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置于15 mL具塞试管中，挥干，冷却，然后加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得)0.2 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀后在70 ℃水浴中加热15 min，迅速置冰浴中冷却，5 min后取出，之后准确加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法[《中华人民共和国药典》(四部)通则0401]，在546 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

2.1.2 灵芝总三萜得率测定 将超声提取后的提取液按照“2.1.1”项下方法测定其吸光度，并通过回归方程计算出总三萜质量，根据得到的灵芝子实体总三萜质量与原料质量，计算灵芝子实体总三萜的得率。

2.2 单因素实验

2.2.1 溶剂的选择及溶剂容积分数的选择 准确称取赤芝、紫芝子实体粉末2.00 g，料液比为1∶20 g/mL、超声时间为20 min、超声温度为50 ℃，用于提取灵芝，考察甲醇或乙醇溶剂以及溶剂容积分数为20%、40%、60%、80%、100%条件下赤芝、紫芝总三萜得率。

2.2.2 料液比的选择 准确称取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶剂及溶剂容积分数由“2.2.1”项确定，超声时间为20 min、超声温度为50 ℃，以灵芝子实体全部浸于甲醇中为起始值，即1∶20 g/mL，故考察料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL条件下赤芝、紫芝总三萜得率。

2.2.3 超声时间的选择 准确称取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶剂及溶剂容积分数由“2.2.1”项确定，料液比由“2.2.2”项确定，超声温度为50 ℃，考察超声时间为10、20、30、40、50 min条件下的赤芝、紫芝总三萜得率。

2.2.4 超声温度的选择 准确称取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶剂及溶剂容积分数由“2.2.1”项确定，料液比由“2.2.2”项确定，超声时间由“2.2.3”项确定，考察超声温度为30、40、50、60、70 ℃条件下赤芝、紫芝总三萜得率。

2.3 Box-Behnken响应面试验设计 根据单因素实验结果，考察超声温度(A)、超声时间(B)、料液比(C)3个因素对灵芝子实体总三萜得率的影响，设计Box-Behnken响应面试验。见表1。

表1 Box-Behnken响应面试验因素和水平

3 结果

3.1 标准曲线的建立 按照“2.1.1”项下方法得到齐墩果酸线性回归方程：y=9.03x+0.042 2，R2=0.999 2。式中y为吸光值；x为齐墩果酸浓度。

3.2 单因素试验结果

3.2.1 溶剂及其容积分数的选择 本实验观察了无水甲醇和无水乙醇对灵芝总三萜得率的影响。以甲醇为提取溶剂时，赤芝、紫芝子实体中总三萜得率分别为1.12%、0.62%；以乙醇为提取溶剂时，赤芝、紫芝子实体中总三萜得率分别为0.88%、0.46%。图1显示不同容积分数的甲醇对赤芝、紫芝中总三萜得率的影响，结果表明以100%甲醇为提取溶剂时，灵芝子实体中总三萜得率最高。

图1 甲醇容积分数对灵芝子实体总三萜得率的影响

3.2.2 料液比的选择 在1∶20 g/mL至1∶40 g/mL料液比范围内，灵芝总三萜得率逐渐升高，在料液比为1∶40 g/mL时总三萜得率最高，之后得率反而随着料液比的增加而降低。见图2。此现象产生的原因：起初灵芝粉末和溶剂的接触面积随着液料比的增加而扩大，更有利于总三萜的提取，但料液比超过1∶40 g/mL后，溶质已经达到溶解平衡，故提取率不再增加。因此，料液比选用1∶40 g/mL为宜。

图2 料液比对灵芝子实体总三萜得率的影响

3.2.3 超声时间的选择 由图3可知，适当延长超声时间能够提高灵芝总三萜的得率，当超声时间为30 min时得率最大。但当继续延长超声时间时，得率却呈现下降的趋势。因此，超声时间应选在30 min为宜。

图3 超声时间对灵芝子实体总三萜得率的影响

3.2.4 超声温度的选择 由图4可知，当超声温度为50 ℃时，灵芝子实体总三萜的得率达到峰值，进一步升高超声温度，得率反而下降。因此，超声温度应以50 ℃为最佳选择。

图4 超声温度对灵芝子实体总三萜得率的影响

3.3 Box-Behnken响应面试验结果

3.3.1 灵芝子实体响应面结果及验证实验 Box-Behnken试验设计17个三因素、三水平的试验，分别得出赤芝、紫芝子实体中总三萜的得率。见表2。

表2 Box-Behnken 试验设计及结果

3.3.2 赤芝子实体中总三萜提取工艺的Box-Behnken响应面试验结果分析 以灵芝子实体总三萜得率为响应值，将表2中赤芝、紫芝子实体中总三萜得率数据进行响应面回归分析，可得到赤芝子实体中总三萜提取工艺的回归方程:Y=1.19+0.042 50A+0.005 9B-0.018 7C+0.005 5AB-0.023 4AC+0.002BC-0.074 2A2-0.082 8B2-0.033C2；紫芝子实体总三萜提取工艺的回归方程：Y=0.909 25+0.033 1A+0.004 4B-0.016 2C+0.004AB+0.018 4AC-0.000 2BC-0.054 7A2-0.062 3B2-0.026 6C2，式中Y为总三萜得率，A为超声温度，B为超声时间，C为料液比。

表3 赤芝子实体总三萜提取工艺的Box-Behnken响应面试验方差分析结果

表4 紫芝子实体总三萜提取工艺的Box-Behnken响应面试验方差分析结果

3.3.3 Box-Behnken响应面试验图形分析 依据响应面分析试验结果，运用Design Expert 13软件进行回归拟合分析，得到液料比、超声时间、超声温度对灵芝子实体总三萜得率的影响，三维响应面图见图5、图6、图7。

a.赤芝响应面图；b.紫芝响应面图图5 温度和时间的交互作用对灵芝子实体总三萜提取率的影响

a.赤芝响应面图；b.紫芝响应面图图6 温度和料液比的交互作用对灵芝子实体总三萜提取率的影响

a.赤芝响应面图；b.紫芝响应面图图7 料液比和时间的交互作用对灵芝子实体总三萜提取率的影响

从图5可以看出，温度与时间的交互作用接近正圆形，说明这两者交互作用较小，对灵芝总三萜得率影响不大。而图6、图7中料液比与超声时间、超声温度和料液比的交互作用接近椭圆形，表明两者的交互作用较大，对灵芝总三萜得率影响较大，其中超声温度与料液比对灵芝总三萜得率的交互作用具有统计学意义(P<0.05)，这与表3、表4中方差分析的结果一致。

3.3.4 赤芝、紫芝子实体总三萜最佳工艺条件的确定及验证试验

利用Design-Expert 13软件对赤芝、紫芝子实体总三萜的Box-Behnken响应面试验结果进行优化，得出赤芝子实体总三萜的最佳提取条件：料液比为1∶38.09 g/mL，超声时间为30.416 min，超声温度为52.584 ℃，最佳条件下，总三萜预测最高提取率为1.194%；得出紫芝子实体总三萜的最佳提取条件：料液比为1∶27.787 g/mL，超声时间为30.444 min，超声温度为52.685 ℃。最佳条件下，总三萜预测最高提取率为0.915%。为检验预测结果的可靠性，兼顾操作的便利性，将赤芝子实体总三萜最佳提取条件进行修正：料液比为1∶38 g/mL，超声时间为30 min，超声温度为53 ℃；将紫芝子实体总三萜最佳提取条件修正为：料液比为1∶28 g/mL，超声时间为30 min，超声温度为53 ℃。进行3次重复试验，测得赤芝子实体总三萜的平均提取率为1.202 3%，与预测值比较，其RSD值为1.13%；紫芝子实体总三萜的平均提取率为0.923 7%，与预测值比较，其RSD值为0.86%。结果表明，Box-Behnken响应面试验优选的赤芝、紫芝子实体提取工艺模型真实、可靠，适用于其子实体总三萜的提取。

4 讨论

本研究在单因素实验的基础上，依据Box-Behnken实验设计并采用Design-Expert 13软件分析优化赤芝、紫芝子实体总三萜提取工艺。得到赤芝子实体总三萜最佳提取条件：料液比为1∶38 g/mL，超声时间为30 min，超声温度为53 ℃；紫芝子实体总三萜最佳提取条件：料液比为1∶28 g/mL，超声时间为30 min，超声温度为53 ℃。两个品种的预测值和实验值之间具有良好的相关性，说明此模型可靠，可运用于超声提取赤芝、紫芝子实体中总三萜的工艺研究。

灵芝作为珍贵的药食同源类中药材，所含成分应用广泛，在医药、保健、化妆品及食品行业潜力较大，是天然的食用、药用滋补良品。响应面法可对单因素的作用以及因素之间的交互作用进行回归分析，能克服正交试验设计只能剖析离散数据、预测性不高的弊端。本研究结果表明，在优化的提取条件下，赤芝子实体中总三萜提取得率较紫芝子实体更高，本研究可为进一步精确分析赤芝、紫芝中差异成分提供实验依据，为后续产品开发奠定基础。