三化汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的保护作用❋

李雯洁， 巩子汉， 黄 颖△， 孙明杰

(1.中国中医科学院医学实验中心， 北京 100700；2.中国中医科学院中医基础理论研究所， 北京 100700)

缺血性卒中约占脑卒中的68%～80%，是全球导致居民死亡和致残的主要原因之一[1]，目前为我国居民死亡原因之首[2]。恢复缺血组织血液供应是急性缺血性卒中治疗的主要措施[3]，然而快速再灌注可损伤血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)，其主要病理机制为构成BBB的重要部分脑微血管内皮[4]功能障碍、通透性改变及炎性细胞因子异常[5]。近年研究发现，Krüppel样因子(krüppel-like factor，KLF)家族中的KLF2对维持血管内皮完整性至关重要[6]，可以通过调控内皮关键基因和蛋白质，从而调节内皮功能，因此KLF2被认为是一种新型的脑卒中保护因子[7]。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)作为调节血管内皮依赖性舒张功能相关因子，与调节凝血功能的血栓调节蛋白(Thrombomodulin)在脑缺血再灌注损伤(cerebral ischaemia-reperfusion injury，CIRI)中均发挥了重要作用[8，9]。研究KLF2及eNOS、Thrombomodulin在CIRI过程中的表达，对改善BBB功能、治疗缺血性卒中具有重要意义。

三化汤出自金元时期刘完素所著《素问病机气宜保命集·中风论第十》，是治疗脑卒中的经典方剂，具有较好的临床疗效。三化汤以理气药与祛风药相伍，具有升降同调、内外同治、祛风理气之效。方中大黄、厚朴、枳实斡旋中焦气机；羌活作为祛风药清扬升散、祛风通络，与大黄、枳实、厚朴相反相成，引导诸药上行入脑发挥治疗作用。研究证实，三化汤对CIRI大鼠脑组织具有保护作用[10，11]，可有效减轻缺血再灌注大鼠BBB损伤[12]，但其机制尚不明确。本课题组前期研究发现，三化汤能显著降低缺血再灌注大鼠脑组织梗死面积，对脑组织病理形态及超微结构具有改善作用[13]。本研究以血脑屏障通透性、脑微血管内皮相关因子KLF2、Thrombomodulin、eNOS为切入点，阐明三化汤保护脑缺血再灌注损伤的作用机制，并进一步探讨祛风药羌活在三化汤中的配伍作用机制。本研究通过中国中医科学院医学实验中心伦理委员会批准。

1 材料

1.1 动物

SPF级8周龄雄性SD大鼠150只，体质量250～270 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0006。饲养于标准动物房,温度20～25 ℃，相对湿度40%～60%，12 h明/12 h暗，动物自由摄食摄水。

1.2 药物及制备

三化汤由枳实20 g、厚朴20 g、大黄20 g、羌活20 g组成，原药材均购自北京同仁堂(集团)有限责任公司。饮片加水浸泡30 min，武火沸腾后文火继续煎煮30 min获得水煎液，将药材残渣加水继续煎煮，合并2次水煎液，浓缩至含生药1 kg/L冷藏备用。三化汤去羌活组(简称去羌活组)去除羌活，煎煮方法同上。羌活组用药为单味羌活，煎煮方法同上。尼莫地平片(国药准字H20043915，规格30 mg×50片，批号1902001)购于天津市中央药业有限公司。

1.3 主要试剂及仪器

大鼠MCAO线栓(北京西浓科技有限公司，货号2838-A4)；伊文思蓝(evans blue，EB，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号E104208)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(北京索莱科技有限公司，货号P1200)；一步法快速WB(HRP)试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2029M)；mRNA逆转录试剂盒、mRNA扩增试剂盒(普洛麦格生物技术有限公司，货号A6002、A6010)；KLF2抗体(美国Raybiotech，货号144-64418-100)；eNOS抗体(美国Cell Signaling Technology，货号D9A5L)；Thrombomodulin一抗(英国Abcam，货号ab187075)；GAPDH抗体(北京博奥森生物技术有限公司，货号bs-10900R)。

CFX Connect型荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)；DYCZ-40D型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；GADPH、KLF2、Thrombomodulin、eNOS引物由上海生工公司合成。

2 方法

2.1 分组与模型建立

大鼠适应性喂养7 d后随机分为正常组、假手术组、造模组，造模组大鼠均采用Longa线栓法建立MCAO模型[14]。术前大鼠禁食不禁水12 h，1%戊巴比妥钠溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，备皮消毒颈部皮肤，暴露右侧颈动脉三角，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA) 、颈外动脉(external carotid artery，ECA) 和颈内动脉(internal carotid artery，ICA)。在近心端结扎CCA、ECA，用小动脉夹暂时夹闭 CCA 远心端近分叉部，在 CCA 近心端距分叉部4 mm处剪一小口，将带有石蜡头的栓线插入到 CCA，松开小动脉夹，从血管分叉处进入 ICA，当线栓插入深度距分叉处约18 mm时稍遇阻力即停止，于 CCA 远心端用细线结扎，用蘸有碘伏的医用棉签对内部进行消毒，缝合伤口后再消毒。术后观察1.5 h，将栓线拔出约1 cm行再灌注。假手术组除不插入线栓外其余操作均与模型组相同。手术过程中尽量遵循无菌操作原则，造模后应用Zea-Longa法对大鼠进行评分，评分在1～3分者视为造模成功，纳入后续实验。将70只造模成功大鼠按照随机数字表分为模型组、尼莫地平组、去羌活组、羌活组、三化汤组，每组14只。

2.2 给药

术后24 h，以体表面积比率换算法计算大鼠给药量，尼莫地平组以尼莫地平溶于0.9%氯化钠溶液灌胃，给药剂量为0.0108 g/kg；三化汤组、去羌活组、羌活组分别给予相应中药水煎液灌胃，给药剂量分别为7.2 g/kg、5.4 g/kg、1.8 g/kg。正常组、假手术组、模型组大鼠采用与给药组相同体积的蒸馏水在相同时间点灌胃，每日1次，连续灌胃5 d。

2.3 脑组织EB含量测定

末次灌胃后，用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠(40 mg/kg)。每组取8只大鼠，股静脉注射2%EB溶液(4 mL/kg)，1.5 h后用0.9%氯化钠溶液左心室灌注至右心耳流出澄清液体，断头取右侧半脑梗死区大脑皮层，称其湿重后加入甲酰胺中匀浆。离心取上清，用分光光度计检测630 nm处的吸光度值。通过EB标准曲线计算出上清液的EB浓度，依据公式计算脑组织中EB含量[15]。脑组织EB含量(ug/g)=浸泡脑组织的甲酰胺溶液体积(mL)×待测样品中EB浓度(ug/mL)/脑组织重量(g)。

2.4 Western blot检测脑梗死区KLF2、eNOS、Thrombomodulin蛋白的表达

将每组剩下的6只动物麻醉后断头处死，取各组大鼠梗死区脑组织称重，正常组、假手术组参考《大鼠立体定位图谱》选取视交叉至脑桥属大脑中动脉供血区域取材。取大鼠脑组织100 mg，BCA法检测总蛋白含量电泳、转膜。采用康为一步法试剂盒进行封闭孵育，Blocking Buffer室温封闭5 min，洗膜后加入稀释一抗GAPDH(1∶5000)，Thrombomodulin(1∶1000)，eNOS(1∶1000)，KLF2(1∶1000)室温孵育45 min，洗膜10 min，ECL化学发光法显影。ImageJ软件计算各条带灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值计算样品目的蛋白相对表达量。

2.5 荧光定量PCR检测脑梗死区KLF2、eNOS及Thrombomodulin mRNA表达

取各组脑组织约30 mg，按照10∶1比例加入Trizol溶液，提取总RNA，逆转录为cDNA，SYBR法进行PCR扩增。2-△△Ct法计算目的基因相对表达水平，各检测指标引物由上海生工合成(见表1)。

表1 引物序列表

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠脑组织中EB含量比较

表2示，与正常组比较，模型组大鼠脑组织EB含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，三化汤组、羌活组、尼莫地平组大鼠脑组织EB含量均显著降低(P<0.05)，去羌活组大鼠脑组织EB含量有降低趋势，但差异无统计意义。

表2 各组大鼠脑组织中伊文思蓝(evans blue，EB)含量比较

3.2 各组大鼠脑梗死区KLF2、Thrombomo-dulin、eNOS蛋白表达比较

图1表3示，与正常组比较，模型组大鼠脑组织KLF2表达量显著下降(P<0.05)，Thrombomodulin与eNOS表达均显著上调(P<0.01)；与模型组比较，三化汤组、羌活组大鼠脑梗死区KLF2表达均显著上调(P<0.05，P<0.01)，三化汤组、羌活组和尼莫地平组脑梗死区Thrombomodulin蛋白、eNOS蛋白表达均显著下降(P<0.05，P<0.01)，去羌活组大鼠脑梗死区各指标表达差异无统计学意义。

注：Krüppel样因子(krüppel-like factor，KLF)-2；内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)；血栓调节蛋白(Thrombomodulin，Thbd)图1 各组大鼠脑梗死区KLF2、Thrombomodulin及eNOS蛋白条带图

表3 各组大鼠脑梗死区中KLF2、Thrombomodulin及eNOS蛋白表达比较

3.3 各组大鼠脑梗死区KLF2、Thrombo-modulin 及eNOS mRNA表达水平比较

表4示，与正常组比较，模型组大鼠脑组织KLF2 mRNA表达水平显著降低(P<0.01)，Thrombomodulin 与eNOS mRNA表达水平均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，三化汤、羌活组大鼠脑组织KLF2 mRNA表达水平均显著增加(P<0.05，P<0.01)，三化汤组、羌活组、尼莫地平组大鼠脑组织Thrombomodulin 与eNOS mRNA表达水平均显著下降(P<0.05，P<0.01)；去羌活组大鼠脑组织上述指标与模型组比较差异无统计学意义。

表4 各组大鼠脑梗死区KLF2、Thrombomodulin及eNOS mRNA表达水平比较

4 讨论

BBB作为血液与中枢神经系统之间的屏障，具有高度选择性，可防止血液中有害物质进入大脑[16]，对于维持中枢神经系统正常运作的微环境至关重要[17]。CIRI可引起BBB结构和功能损伤，从而引起继发性脑损伤[18]。因此，改善CIRI后BBB通透性对保护神经元、维持中枢神经系统正常功能具有重要意义。血管内皮是构成BBB的关键部分，也是CIRI过程中的重要靶器官[19]，维护其完整性和功能正常对于维护BBB有重要意义。KLF2作为核转录因子，可直接影响炎症及抗血栓等多种调控途径，不仅对脑缺血有直接保护作用[20]，还可通过维持血管内皮完整性及调节内皮功能[21]改善BBB功能。研究表明，过表达KLF2可增强内皮屏障功能，减少炎症刺激下的血管渗漏[22]。本研究发现，羌活和三化汤均能上调模型大鼠KLF2 mRNA及蛋白的表达，提示羌活及三化汤可能通过调控KLF2表达，保护血管内皮，从而减轻CIRI后BBB损伤。

eNOS是内皮依赖性舒张功能因子，主要存在于内皮细胞中，催化L-精氨酸合成内皮NO[23]。Sanches SC[24]发现，CIRI期间内皮功能受损会产生过量eNOS，核黄素可通过降低eNOS /诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)和NO水平发挥抗氧化和抗炎作用，从而保护细胞免受缺血再灌注损伤。此外研究表明，过量NO的可增加BBB通透性[25，26]，还可能通过抑制三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的合成[27]损伤血管内皮，故降低CIRI后eNOS的表达水平对调节内皮功能、保护血管内皮具有积极意义。Thrombomodulin作为存在于人体内皮细胞表面的跨膜糖蛋白，在调节凝血级联中起关键作用[28]。Tomoda等[29，30]认为，Thrombomodulin是内皮功能障碍的重要标志物，可通过促进平滑肌细胞增殖加速动脉硬化。此外，内皮细胞受损时，Thrombomodulin还可释放入血使游离的凝血酶增多，进一步加重BBB损伤[31]。在本研究中，三化汤组、羌活组eNOS、Thrombomodulin表达较模型组显著下降，提示三化汤与羌活可能通过调节内皮功能保护血管内皮，减轻BBB损伤。

三化汤是治疗脑卒中的经典方剂，在临床发挥了较好的治疗作用[32，33]。本研究结果表明，三化汤改善脑缺血再灌注作用与保护血脑屏障功能密切相关，其机制可能为通过上调KLF2表达、抑制Thrombomodulin和eNOS表达以维护脑微血管内皮完整性，从而改善血管内皮功能。此外，本研究结果显示，羌活能显著减少EB渗透量，调节KLF2、Thrombomodulin和eNOS表达，提示祛风药羌活在三化汤保护脑缺血再灌损伤中发挥了重要作用，可深入探索羌活的作用机制。