新型“开式”环金属铱配合物次氯酸盐荧光探针的合成与应用

王婷婷，任美娟，吴芳辉*，叶明富，2，叶晶晶，查习文

（1.安徽工业大学 化学与化工学院，安徽 马鞍山 243000；2.成都信息工程大学 信息材料及器件化应用四川省高校重点实验室，四川 成都 610225）

日常生产和生活中，次氯酸盐（ClO-）广泛用作污水处理中的氧化剂，造纸和纺织工业生产中的漂白剂，也用于饮用水消毒［1］。水处理过程中，残留氯的浓度必须严格控制在mmol/L至µmol/L范围内［2］，这是因为低浓度的游离氯无法杀死水中的细菌和病毒，并对公众健康构成巨大威胁，而消毒水中过量的次氯酸盐残留物可引起眼睛、鼻子刺激和胃部不适，还会产生三卤甲烷和卤乙酸等不良或有毒的副产物［3］。另一方面，髓过氧化物酶催化Cl-与H2O2反应产生的内源性ClO-作为活性氧（ROS）物种在生物系统中发挥着关键作用，但非正常水平的ClO-会损害宿主组织，诱发关节炎、心脑血管和肾脏疾病甚至是癌症［4-5］。因此，简单高效地检测ClO-具有十分重要的研究意义。

目前已使用的测定ClO-的分析方法包括比色法［6］、电化学法［7］、碘滴定法［8］和高效液相色谱法（HPLC）［9］等。这些常规方法有些需要复杂的样品前处理过程，有些设备昂贵、测试周期长。相对而言，响应快速、仪器价廉、选择性好、可视化性强、样品处理要求简单的荧光分析法具有更广的应用潜力［10-11］。基于ClO-氧化含硫酯、硫醚、氨基、苯醚等官能团配体的配合物荧光探针近年来屡见报道［12-13］，然而部分探针合成过程较复杂，且灵敏度低、选择性欠佳，限制了其进一步应用和推广。因此具有发光效率高、斯托克斯位移大、寿命长等优点的环金属铱配合物在荧光传感领域脱颖而出。该配合物可通过灵活改变配体的结构调节发光特征，实现对不同目标物的特异选择性识别与超灵敏检测［14-15］。

本文以苯并喹啉（bzq）为主配体，4'-甲基-2，2'-联吡啶-4-甲醛肟（标记为L1）作为辅助配体，合成了一种有一定亲水性的环金属铱（Ⅲ）配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）。该配合物上的C==N—OH 基团可与ClO-发生氧化反应生成羧酸，抑制了因基团异构化导致的非辐射衰变过程，从而可发射出强荧光，基于此构建了一种新型快速识别和宽浓度范围检测ClO-的荧光探针。通过优化实验条件发现，该铱配合物对ClO-的识别选择性高、抗干扰性强，配合物的荧光强度值与ClO-浓度在一定范围内呈良好的线性关系。采用核磁共振氢谱详细研究了荧光响应机理，最后成功利用该荧光传感体系检测了真实样品中的ClO-浓度。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

三氯化铱、苯并喹啉、二氧化硒、4，4'-二甲基-2，2'-联吡啶、乙氧基乙醇、六氟磷酸钾均购于上海泰坦科技股份有限公司；二烷、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）购于上海阿拉丁试剂有限公司，甲醇、乙醚等其它试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。所有化学试剂均为分析纯，使用前未经进一步纯化。

环金属铱配合物的合成在氩气气氛中进行，实验中均采用超纯水，所有溶液在室温下现配现用；将NaClO 溶于PBS 缓冲溶液中（10 mmol/L，pH 9.0）获得ClO-溶液，通过292 nm 处的吸光度（其摩尔吸光系数为350 mol-1·L·cm-1）确定其浓度；超氧自由基（O2-）、单线态氧气1O2以及羟基自由基*OH等活性氧溶液根据文献［16］现配现用。

合成的配合物通过300 ～400 目柱层层析用硅胶纯化；采用美国Nicolet/Nexus-870 FT-IR 型红外光谱仪记录红外光谱数据；化合物的所有核磁共振谱数据均通过德国布鲁克公司的Bruker Avance Ⅲ400 MHz 型核磁共振仪测量，其中四甲基硅烷（TMS）为内标，以氘代氯仿或氘代二甲亚砜溶解产物；使用美国PE公司LS55型荧光光谱仪和日本岛津公司生产的UV-2700型紫外可见分光光度仪分别测定荧光和紫外可见吸收光谱；采用德国Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF 质谱仪测定铱配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）、其与ClO-作用后分离出的产物以及直接合成产物［Ir（bzq）2（L2）］（PF6）的相对分子量；采用德国Elementar UNICUBE 有机元素分析仪获知配合物中碳、氢、氮3种元素的实际含量。

1.2 合成部分

1.2.1 苯并喹啉铱二聚体［Ir（2bzq）4Cl2］的合成根据文献［17］采用改进后的方法合成苯并喹啉铱二聚体，即在脱气后的9 mL乙氧基乙醇-水（体积比3∶1）混合溶剂中加入149.3 mg（0.50 mmol）三氯化铱和197.1 mg（1.10 mmol）苯并喹啉，于150 ℃下加热回流反应12 h 后，冷却至室温，减压过滤得棕黄色的固体。依次用少量正己烷（3×3 mL）和乙醚（3×3 mL）洗涤，最后于真空干燥箱50 ℃下干燥12 h，得到橘黄色粉末产物214.5 mg（产率76%）。1H NMR（400 MHz，CDCl3，298 K）δ：9.35（d，J= 4.0 Hz，3H），8.28（d，J= 8.0 Hz，4H），7.76-7.67（m，10H），7.21-7.14（m，8H），6.83-6.79（m，4H），5.98（d，J=8.0 Hz，3H）。

1.2.2 4'-甲基-2，2'-联吡啶-4-甲醛的合成参考文献［18］方法称取1.8424 g（10.00 mmol）4，4'-二甲基-2，2'-联吡啶和1.1151 g（10.05 mmol）二氧化硒于100 mL 烧瓶中，加入50 mL 1，4-二氧六环后于110 ℃加热回流24 h，趁热过滤除去硒沉淀，冷却至室温，静置1 h 后再次过滤除去浅黄色4'-甲基-2，2'-联吡啶-4-羧酸沉淀；剩余溶液脱除溶剂后重新溶于500 mL 乙酸乙酯中，采用20 mL 碳酸钠水溶液（0.10 mol/L）萃取以除去残留的羧酸，随后用30 mL 焦亚硫酸钠水溶液（0.20 mol/L）萃取3 次，形成焦亚硫酸盐醛；再加入碳酸钠溶液（0.10 mol/L）将上述萃取液调至pH 10.0 左右，最终用30 mL 二氯甲烷萃取3 次，脱除二氯甲烷萃取液，制得4'-甲基-2，2'-联吡啶-4-甲醛白色粉末792.9 mg（产率40%）。1H NMR（400 MHz，CDCl3，298 K）δ：10.18（s，1H），8.89（d，J= 4.0 Hz，1H），8.83（s，1H），8.57（d，J= 4.0 Hz，1H），8.28（s，1H），7.72（d，J= 4.0 Hz，1H），7.19（d，J= 4.0 Hz，1H），2.47（s，3H）。

1.2.3 4'-甲基-2，2'-联吡啶-4-甲醛肟（L1）的合成参考文献［19］方法在盛有396.4 mg（2.00 mmol）4'-甲基-2，2'-联吡啶-4-甲醛的烧瓶中加入15 mL 无水乙醇，随后分别加入0.38 mL（2.80 mmol）三乙胺和119.5 mg（1.73 mmol）盐酸羟胺，将反应混合物于80 ℃加热回流12 h，向所得溶液中加入水，即析出大量白色固体，过滤并用水（3 mL）洗涤3 次，干燥后将所得固体加入石油醚-乙酸乙酯（体积比20∶1）混合溶剂中，超声10 min，待杂质充分溶解后过滤得固体产物，置于真空干燥箱中于40 ℃干燥12 h即得218.1 mg 白色粉末（产率55%）。1H NMR（400 MHz，D6-DMSO，298 K）δ：11.72 （s，1H），8.81（s，1H），8.74（d，1H），8.58（J=4.0 Hz，1H），2.50（s，3H）。

1.2.4 配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的合成称取282.3 mg（0.25 mmol）苯并喹啉铱二聚体和106.6 mg（0.50 mmol）L1溶于30 mL甲醇-二氯甲烷（体积比1∶2）混合溶剂中，避光搅拌1 h，随后于50 ℃加热回流6 h，冷却至室温后，加入含有92.1 mg（0.50 mmol）六氟磷酸钾的2 mL甲醇溶液，搅拌30 min，脱除溶剂后所得固体再次溶解于5 mL二氯甲烷中，并用二氯甲烷-甲醇（体积比50∶1）作为洗脱液，经硅胶柱分离得到配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的橙红色固体228.6 mg（产率60%）。1H NMR（400 MHz，CDCl3，298 K）δ：8.86（s，1H），8.63（s，1H），8.25（d，J= 8.0 Hz，2H），8.00-7.66（m，9H），7.49-7.00（m，7H），6.61（d，J= 8.0 Hz，1H），6.33（t，J1= 8.0 Hz，J2= 8.0 Hz，2H），2.58（s，3H）。C38H27IrN5O元素分析理论值：C，59.91；H，3.57；N，9.19。测定值：C，58.85；H，4.80：N，8.42。ESI MS（m/z）：理论值为762.18，实际值为762.03（［M-PF6］+）。

1.2.5 配合物［Ir（bzq）2（L2）］（PF6）的合成配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）被ClO-氧化的产物［Ir（bzq）2（L2）］（PF6）可由107.1 mg（0.50 mmol）4'-甲基-2，2'-联吡啶-4-甲酸（L2）与282.3 mg（0.25 mmol）苯并喹啉铱二聚体［Ir2（bzq）4Cl2］参照“1.2.4”直接合成，最后以二氯甲烷-甲醇（体积比50∶1）为洗脱液经硅胶柱分离后得到棕黄色固体252.9 mg（产率65%）。1H NMR（400 MHz，CDCl3，298 K）δ：9.09（s，1H），8.43（s，1H），8.21（d，J= 4.0 Hz，2H），7.98-7.79（m，7H），7.77（d，J= 4.0 Hz，1H），7.64-7.61（d，J= 4.0 Hz，2H），7.50-7.40（m，4H），7.15-7.08（m，3H），6.31-6.27（t，J1= 4.0 Hz，J2=4.0 Hz，2H），2.50（s，3H）。C38H26IrN4O2元素分析理论值：C，59.83；H，3.44；N，7.34。测定值：C，60.01；H，3.91；N，6.59。ESI MS（m/z）：理论值为763.17，实际值为763.06（［M-PF6］+）。上述合成过程如图1所示。

图1 ［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）和［Ir（bzq）2（L2）］（PF6）的合成路线图Fig.1 Synthetic route of complex［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）and［Ir（bzq）2（L2）］（PF6）

1.3 荧光测量

所有实验均在室温下进行，采用长度为1 cm，容积为3 mL的石英比色皿测试样品的荧光光谱。配制20µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的DMF-磷酸盐（PBS）（10 mmol/L，pH 9.0，体积比9∶1，下同）溶液，观察加入一定量ClO-水溶液后的荧光变化；荧光滴定实验则是在20 µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的DMF-PBS 溶液中加入不同浓度ClO-（0.1µmol/L ～6 mmol/L）后记录450 ～800 nm 范围内的荧光光谱，激发波长为420 nm。

2 结果与讨论

2.1 配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）对ClO-的荧光识别研究

向20 µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的DMF-PBS 溶液中加入5 mmol/L ClO-，配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的荧光显著增强，且在紫外灯（365 nm）下同步观察到［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的颜色在3 s之内由暗棕色迅速转变为明亮的橙黄色（图2），说明［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）可作为ClO-肉眼识别的指示剂，推断［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）与ClO-的强相互作用使得［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）上的甲醛肟基团被ClO-氧化，诱导C==N键断裂，抑制了非辐射过程，导致其荧光显著增强。

图2 20µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）溶液在不含和含有5 mmol/L ClO-时于420 nm处的荧光激发光谱图Fig.2 The fluorescence spectra of 20µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）in the absence and presence of 5 mmol/L ClO-with an excitation of 420 nminset：luminescence images of the complex under the ultraviolet light before and after adding ClO-

2.2 实验条件优化

为了进一步研究［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）对ClO-的识别效果，对DMF和PBS缓冲溶液组成的混合溶剂配比、溶剂pH值、配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的用量等进行了优化。发现当混合溶剂中PBS体积分数从10%逐渐增大至60%时，［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）探针对ClO-的响应持续急速减弱，因此为了保证探针对ClO-的最佳识别效果，后续实验选择DMF-PBS混合溶剂的体积比为9∶1。进一步研究了PBS（10 mmol/L）的pH值在6.0 ～10.0之间时对体系荧光响应的影响，由图3可见，仅含［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）探针的DMF-PBS溶液在pH值为6.0 ～10.0时，几乎无荧光发射，但向体系中加入1 mmol/L ClO-后，荧光显著增强，且当混合溶剂中PBS的pH值为9.0时荧光强度最大，之后开始下降，因此选择10 mmol/L pH 9.0 的PBS 缓冲溶液构建的DMF-PBS混合溶剂（体积比9∶1）作为后续研究介质。考察了不同浓度的［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）对ClO-荧光响应的影响，发现当［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）浓度为20µmol/L 时，信号增强比例最大且较为稳定，故本实验选择浓度为20µmol/L的［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）作为荧光试剂。

图3 DMF-PBS混合溶剂中PBS的pH值对［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）（20µmol/L）荧光强度的影响Fig.3 The effect of pH value of PBS in DMF-PBS mixed solvent on fluorescent intensity of［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）（20µmol/L）

2.3 ［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）荧光探针对ClO-的选择性及干扰性

在含有［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的DMF-PBS 溶液中分别加入与1 mmol/L ClO-等量的Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Pb2+、Mg2+、Ca2+、Co2+阳离子，Cl-、阴离子以及生物 高 活 性 物 质CH3COO-、OH、半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）观察响应情况。如图4A 所示，只有在加入ClO-后［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）体系的荧光明显增强，其他物质对探针的荧光几乎没有影响。紫外灯（365 nm）下［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）加入上述不同离子的响应照片（图4B）也显示，只有加入ClO-后，配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的荧光有显著变化，表明［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）荧光探针对ClO-响应的特异选择性高。

图4 20µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）溶液加入1 mmol/L各种离子后的荧光响应（A）及对应的紫外灯下的照片（B）Fig.4 The fluorescence response of 20µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）solution after adding 1 mmol/L various ions（A）and the photographs under 365 nm ultraviolet lamp（B）

通过竞争性实验评估了［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的抗干扰能力，发现在［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）与ClO-反应后的体系中加入等量可能共存的离子如Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Pb2+、Mg2+、Ca2+、Cl-、以及CH3COO-对荧光几乎没有影响，表明复杂环境中［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）识别ClO-有较强的抗干扰性。

2.4 ［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）对ClO-荧光响应的检出限

通 过 向20 µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的DMF-PBS 溶 液 中 滴 加 不 同 浓 度 的ClO-（0 ～6 mmol/L），研究了ClO-浓度对［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）荧光强度的影响，如图5A 所示。结果表明，配合物的荧光强度随着ClO-浓度的增加而显著增加，当加入5 mmol/L ClO-时体系荧光发射强度约增强22 倍，之后增加ClO-的浓度至6 mmol/L，［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的荧光强度反而轻微降低（图5A中虚线），这是因为［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）与ClO-之间的结合已经达到饱和。另外，随着ClO-的加入，［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）在595 nm 处的荧光峰轻微红移至600 nm处。

计算发现，ClO-浓度在0.1～210µmol/L之间变化时，［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的荧光强度（I）与ClO-的浓度（c）存在良好的线性关系（图5B），线性方程为I= 18.6324cClO-（µmol/L）+ 2435.1873，相关系数（r）达0.9991，根据3σ S计算得到检出限（LOD）为3.08 nmol/L，根据10σ S计算得到定量下限（LOQ）为10.3 nmol/L。与已有的其它铱配合物荧光传感材料［20-23］对比（表1），制备的［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）探针具有检出限低、线性范围宽的优点。此外采用［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）探针平行测定1 mmol/L 的ClO-10次，相对标准偏差（RSD）仅为1.8%，表明该方法的重现性和稳定性较好。

表1 各种环金属铱配合物荧光分析法测定ClO-的性能比较Table 1 Comparison of the cyclometallic iridium complex fluorescent sensors for ClO-

图5 20µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）溶液中加入不同浓度ClO-（0 ～6 mmol/L）后的荧光发射光谱图（A）及ClO-浓度与［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）探针发光强度之间的关系图（B）Fig.5 Fluorescence spectra of 20µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）solution with various concentrations of ClO-（0-6 mmol/L）（A）and the relationship between different concentrations of ClO-and emission intensity of the［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）（B）

探针对目标分析物的响应时间在实际应用中也很重要。向20µmol/L［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的DMFPBS 溶液中加入线性范围上限浓度的ClO-（210µmol/L）时，可在365 nm 紫外灯下肉眼观察到探针的颜色由暗棕色逐渐转为明亮的橙黄色。荧光光谱仪测试发现，该体系荧光强度可在1 min内达到峰值并保持稳定，证实了荧光探针的实用性。

2.5 ［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）对ClO-的荧光响应机理

物质的构象可以影响其光物理性质，［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）中含有能够异构化的C==N—OH 基团，导致其激发态衰减，荧光量子产率低，只发出微弱的荧光［24］。通过与ClO-的氧化反应可去除探针分子中的C==N—OH 基团，抑制C==N 基团异构化，显著增强［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的荧光［25］。为了证实上述推断，采用傅里叶红外光谱仪分别测定了［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）加入ClO-前后的红外光谱，发现加入ClO-后，体系在1718 cm-1处出现了明显的C==O伸缩振动特征峰，表明配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）上的C==N—OH基团已被氧化为羧基。随后采用紫外可见吸收光谱仪研究了［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）加入ClO-后的光谱变化，结果显示随着ClO-的不断加入，268 nm 处与联吡啶和环金属苯并喹啉配体π-π*吸收相对应的强吸收峰时吸光度逐渐下降，峰位置不断红移，而330 ～400 nm 范围内对应金属-配体电荷转移吸收（MLCT）的弱吸收宽峰［26］的吸光度缓慢升高，当ClO-浓度达到17.5µmol/L时，吸光度不再变化。以上现象证实［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）与ClO-之间发生了反应［27］。

此外，［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）以及［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）与ClO-的反应产物［Ir（bzq）2（L2）］（PF6）的1H NMR也可以证实上述反应机理。如图6所示，［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）中HbC==N—OHa基团的Ha质子信号位于8.86，Hb质子信号位于8.64左右，当其与ClO-反应后，Ha和Hb质子信号几乎消失，而在化学位移9.09附近明显出现了可能对应于羧基基团的质子峰，表明［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）中的C==N—OH基团被ClO-氧化成含有羧基基团的［Ir（bzq）2（L2）］+，抑制了C==N—OH基团的快速异构化，阻碍了其激发态衰变过程，使得［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）的荧光增强，从而可用于ClO-检测。进一步的质谱研究表明，［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）与ClO-反应后分离出的产物在763.02处检测到阳离子峰（［M-PF6］+），与［Ir（bzq）2（L2）］（PF6）的阳离子峰（763.06）几乎完全一致，表明ClO-促进了［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）中的C==N—OH 基团氧化为—COOH。

图6 ［I（rbzq）（2L1）］（PF6）、［I（rbzq）（2L1）］（PE6）与ClO-的反应产物以及［I（rbzq）（2L2）］（PF6）在CDCl3溶剂中的核磁共振氢谱Fig.6 1H NMR spectra of［Ir（bzq）（2L1）］（PF6），the reaction product of［Ir（bzq）（2L1）］（PF6）treated with ClOand［Ir（bzq）（2L2）］（PF6）in CDCl3 solution

3 实际样品分析

为了验证［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）荧光探针在实际应用中的性能，吸取马鞍山市慈湖河水，过滤后进行加标回收实验，记录相应的荧光强度平均值，每组平行测定6 次，得到回收率为92.4%～103%（表2），RSD均低于5%，表明［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）测定实际样品中ClO-含量的精确度较高。

表2 河水样中ClO-的分析结果（n=6）Table 2 Determination of hypochlorite in river samples（n=6）

4 结论

本文设计并制备了一种新型的含有C==N—OH 基团的环金属铱配合物［Ir（bzq）2（L1）］（PF6），通过ClO-定向特异性的氧化作用，使其中的肟基转化为羧基，抑制C==N的异构化，增强其荧光信号，并由此建立了［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）检测ClO-的新体系。优化实验条件后发现，［Ir（bzq）2（L1）］（PF6）探针的荧光强度与ClO-的浓度在0.1 ～210µmol/L 之间呈良好的线性关系，检出限为3.08 nmol/L。与其它铱配合物荧光探针相比，该探针线性范围宽、选择性和抗干扰性强。用于实际试样中微量ClO-的检测，结果令人满意，有望拓展铱配合物在荧光传感领域的应用潜力。