一种新型一氧化氮比率型近红外荧光探针的制备及应用

张梦田，吴 丽，杜江燕*

（1.南京师范大学 化学与材料科学学院，江苏 南京 210023；2.南通大学 公共卫生学院，江苏 南通 226000）

一氧化氮（NO）是生物体内普遍存在的一种内源性气体分子，由线粒体一氧化氮合成酶在氧气和还原性辅酶Ⅱ（NADPH）参与下催化内源性L-精氨酸分解生成［1］。NO在人体内作为代谢产物形成的控制生理过程的信号分子，广泛参与多种生理和病理过程，在血小板聚集和细胞粘附、心力衰竭、血管舒张、炎症等生命过程中发挥关键作用［2-3］。此外，NO 还与信号转导、中枢神经系统紊乱、平滑肌松弛、分解代谢自噬过程和免疫反应［4-8］密切相关。NO 的生物学效应与其在细胞微环境中的浓度密切相关，对生物体而言，细胞内NO 是一把“双刃剑”，较低浓度的NO 参与免疫及炎症过程的信息传递，促进血管生成和肿瘤生长、转移，而较高浓度的NO则会诱导肿瘤细胞凋亡，具有抗肿瘤作用［9］；在免疫系统中，较低浓度的NO 能抑制T 细胞增殖，起抗炎作用，较高浓度的NO 则会在病原体存在时引起强烈的炎症反应［10］。大量研究表明，NO浓度失调与一些致命疾病密切相关，如青光眼、免疫紊乱、急慢性炎症、内皮功能障碍、神经退行性疾病、动脉粥样硬化、感染性休克和癌症等［11-13］。因此，体内动态检测NO对于研究其在生命活动中的生理机制，以及多种疾病及肿瘤的临床诊断具有非常重要的意义［14］。

与化学发光法、电化学法、电子顺磁共振光谱法或紫外可见吸收光谱法等分析方法相比，荧光探针技术具有灵敏度高、响应快速和抗干扰能力强等优点，是动态检测活细胞及活体中NO 的重要手段［15-17］。例如，Kumar课题组［18］设计并合成了一种溶酶体靶向探针LyNP-NO，可选择性检测活细胞中的NO，用于动态监测大鼠脑组织中的内源性NO 水平。Xu 等［3］设计了一种智能NO 探针PYSNO，该探针对外源性和内源性NO 均表现出快速反应，还可用于跟踪和研究动物组织中NO 的产生。但现有的检测NO 的荧光探针仍存在灵敏度不高、选择性差及信号易受干扰等问题。因此，亟需开发灵敏度高、专一性好的荧光探针提高NO检测的准确度和可靠度。

2，1，3-苯并噻二唑（Benzothiadiazole，BTD）是一种缺电子杂环结构荧光受体，具有优良的化学和光学性能，如斯托克斯位移大、吸电子能力强、光稳定性好等特性。本文将BTD 稠合邻苯二胺获得的［c］［1，2，5］噻二唑-5，6-二胺（［c］［1，2，5］Benzothiadiazole-5，6-diamine，BTN）衍生物，作为NO 的特异性识别基团和电子受体，通过与NO 间的特异性反应识别NO。芴衍生物是一种重要的荧光分子，通过C9 位官能团的修饰可调控荧光性能。将芴衍生物作为给电子基团，噻吩作为π 桥与BTN 共价结合，构建了供体-受体-供体（D-A-D）型荧光探针4，7-双（5-（9，9-二辛基-9H-芴-2-基）噻吩-2-基）苯并［c］［1，2，5］噻二唑-5，6-二胺（4，7-Bis（5-（9，9-dioctyl-9H-fluoren-2-yl）thiophen-2-yl）benzo［c］［1，2，5］thiadiazole-5，6-diamine，BTBTN）。此探针结构中邻苯二胺与NO 反应后形成苯并三氮唑结构，分子内电荷转移（ICT）效应增强，吸收光谱明显红移，荧光探针在红光波段处荧光减弱，而在近红外波段处荧光增强，可实现NO 的比率计量检测。相较于传统的增强型或猝灭型NO 荧光探针，该探针通过比率计量荧光可实现背景荧光低、抗干扰能力强的NO近红外荧光分析和检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

赖氨酸、甘氨酸和抗坏血酸购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DL-同型半胱氨酸、L-半胱氨酸、9，9-二辛基-2-溴芴、N-乙酰-L-半胱氨酸和丙酮醛购于上海麦克林生化科技有限公司；4，7-二溴-2，1，3-苯并噻二唑、谷胱甘肽和一氧化氮供体盐（2-（N，N-二乙基氨基）-二氮烯-2-氧钠盐水合物）购于Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司；实验所用试剂均为分析纯。溶液用二次水配制。

核磁共振碳谱（13C-NMR）、核磁共振氢谱（1H-NMR）测试实验采用Bruker Avance III HD 400 MHz超导核磁共振仪。高分辨率质谱仪（HRMS）采用美国Thermo Fisher Scientific 公司生产的Orbitrap Fusion Lumos。紫外吸收光谱实验采用日本岛津公司生产的UV-1900型紫外可见光谱仪。荧光光谱实验采用英国爱丁堡公司生产的FS-5型荧光光谱仪。

1.2 荧光探针（BTBTN）的合成与表征

1.2.1 化合物BTBTN的合成路线将4，7-二溴-2，1，3-苯并噻二唑（C6H2N2SBr2）与浓硝酸、三氟甲烷磺酸（CF3SO3H）等原料在一定条件下反应生成化合物1（C6O4N4SBr2）；将2-（三丁基锡）噻吩（C16H30SnS）、化合物1、四（三苯基膦）钯［Pd（PPh3）4］在一定条件下反应生成化合物2（C14H6O4N4S3）；将化合物2 溶解于N，N-二甲基甲酰胺（C3H7ON）和乙腈混合溶剂中，分次加入N-溴代琥珀酰亚胺（C4H4NO2Br）和微量溴化氢反应完成后，得到橘红色化合物3（C14H4O4N4S3Br2）；将9，9-二辛基-2-溴芴（C19H41Br）、联硼酸频那醇酯（C12H24O4B2）、无水醋酸钾及［1，1’-双（二苯基膦）二茂铁］二氯化钯二氯甲烷络合物［PdCl2（dppf）2CH2Cl2］等试剂反应得到化合物4（C35H53O2B）；利用Suzuki 偶联反应将化合物4 偶联到化合物3，再投入含有甲醇、K2CO3溶液、Pd（PPh3）4的四氢呋喃溶液中反应得到化合物5（C72H86O4N4S3）；将化合物5、铁粉、乙酸加入密封反应容器中反应得到化合物BTBTN（C72H90N4S3），制备路线如图1所示。

图1 探针BTBTN的合成路线及与NO反应可能的机理Fig.1 Synthesis procedures of probe BTBTN and possible reaction mechanism with NO

1.2.2 探针BTBTN 的核磁共振光谱结果1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 7.76-7.66（m，6H），7.64（s，2H），7.52（d，J=3.7 Hz，2H），7.40（d，J=3.7 Hz，2H），7.37-7.29（m，6H），2.06-1.96（m，8H），1.35-0.93（m，44H），0.81（t，J = 7.1 Hz，12H），0.65（d，J = 7.8 Hz，8H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 151.70（s），150.99（d，J = 14.3 Hz），147.08（s），141.16（s），140.73（s），139.39（s），134.32（s），132.99（s），129.85（s），127.33（s），126.97（s），124.94（s），123.28（s），123.01（s），120.32（d，J = 18.5 Hz），119.88（s），107.51（s），55.35（s），40.59（s），31.93（s），30.19（s），29.38（s），23.93（s），22.74（s），14.23（s），0.14（s）。

1H-NMR和13C-NMR的实验结果表明所得产物为目标化合物BTBTN。

1.3 溶液的配制

BTBTN 储备液的配制：准确称量一定质量的BTBTN 样品，溶解于四氢呋喃（THF）中，配制质量浓度为5 mg/mL的BTBTN贮备液，于4 ℃下避光保存。

HEPES 缓冲液（0.01mol/L，pH 7.4）的配制：准确称取1.1915 g C8H18N2O4S（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）固体，向其中加0.5 L 水，超声、搅拌至完全溶解，得到0.01 mol/L HEPES 酸液。准确称取0.4 g NaOH溶于10 mL水中，配制1 mol/L NaOH 溶液作为碱液。将上述酸液和碱液按照一定比例混合，配制不同pH值的缓冲液。

样品溶液的配制：在比色皿中加入0.665µL HEPES 缓冲液和1.335µL THF，再取2.3µL 探针母液，用1 mL移液枪吹打均匀，制备探针浓度为5µmol/L的样品溶液，总体积为2 mL左右。

NO 溶液的配制：准确称取一定量的NO 供体盐，在一定量的水中加入适量NO，配制质量浓度为5 mg/mL的NO溶液，立即冷冻在-20 ℃冰箱中，现取现用。

1.4 紫外吸收光谱实验

将上述探针溶液（5µmol/L）及HEPES缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）分别加入到两个样品池中，进行紫外吸收光谱测试。为了消除溶剂误差，待初始工作基线稳定后再开始样品的测试。测试BTBTN 与NO响应实验时，在测试液中加入适量浓度的NO储备液（最终浓度50µmol/L）。充分反应后，记录荧光探针紫外吸收峰强度的变化。

1.5 荧光光谱实验

以410 nm 作为样品的激发光波长，狭缝宽度2 nm，向石英比色皿中加入HEPES 缓冲液和样品溶液，使得配制的荧光探针BTBTN 的最终浓度为5µmol/L。测试BTBTN 与NO 响应实验时，在测试液中分别加入适量浓度的NO 储备液（最终浓度为50µmol/L）。充分反应至信号不再变化时，记录荧光探针的最大发射峰强度。

2 结果与讨论

2.1 荧光探针与NO作用的光谱研究

为了考察探针BTBTN 对NO 的响应情况，测定了BTBTN 与NO 反应前后的紫外吸收光谱和荧光光谱。结果如图2A 所示，BTBTN 的紫外光谱（曲线a）在355 nm 处有1 较强吸收峰，在410 nm 处有1 弱吸收峰。加入NO 后（曲线b）显示355 nm 处的吸收峰消失，而410 nm 处的吸收峰明显增强，同时在660 nm 处产生1 新吸收峰，表明BTBTN 与NO 发生了化学反应，有新物质生成，且溶液由红色变为蓝色（如图2A插图）。

图2B 为探针BTBTN 与NO 作用前后的荧光光谱，如曲线a 所示，BTBTN 在410 nm 激发光辐射下，只在640 nm 处有发射峰，且荧光强度较弱。加入NO 后，640 nm 处的发射峰明显降低，且在775 nm 处出现1 明显的发射峰，这可能是由于BTBTN 分子中邻苯二胺的两个氨基基团与NO 发生反应生成了新物质，ICT 效应增强使探针在775 nm 处发出近红外荧光。图2B 插图表明，探针BTBTN 与NO 作用后产生明显的颜色变化，进一步证明BTBTN 与NO 反应产生了新的荧光物质。上述实验结果表明探针BTBTN可用于NO的检测。

图2 探针BTBTN与NO作用前后的紫外吸收光谱（A）及荧光光谱（B）Fig.2 UV-Vis absorption spectra（A）and fluorescence spectra（B）of probe BTBTN in the absence and presence of NO HEPES buffer-THF/H2O（2∶1），pH 7.4；concentration of BTBTN：5µmol/L；λex=410 nm

2.2 荧光探针对NO的检测机理研究

荧光探针BTBTN 是以邻苯二胺修饰的［c］［1，2，5］噻二唑-5，6-二胺作为NO 识别基团和电子受体，基于BTBTN 与NO 反应前后的光谱变化，推测BTBTN 上的邻苯二胺基团与NO 发生环化反应，生成苯并三氮唑结构的产物。为了证实这一推断，考察了BTBTN 与NO 反应前后的高分辨质谱，结果如图3所示。在正离子模式下，BTBTN 在m/z=1107.6 处有1 强的分子离子峰。当探针BTBTN 与NO 反应后，在负离子模式下，m/z=1116.6处出现1新的强分子离子峰（图3B），该数值与化合物BTBTNO的理论相对分子质量（m/z=1117.6）相对应，符合BTBTNO 的三氮唑在质谱中失去了单质子H，表明探针确实被NO还原成化合物BTBTNO，从而验证了图1提出的探针BTBTN与NO反应的机理推测。当探针与NO结合，二氨基苯并-（1，2，5-噻二唑）部分的弱电子受体将转化为具有强吸电子能力的三唑并稠合苯并-（1，2，5-噻二唑），然后生成产物BTBTNO，并由增强的ICT效应开启近红外荧光。

图3 BTBTN（A）及BTBTN与NO反应后（B）的质谱图Fig.3 MS spectra of BTBTN（A）and its reactant after BTBTNO treating with NO（B）BTBTN：Calc. for C72H90N4S3：1106.6328. Found：1107.57［MA+H］+；BTBTNO：Calc. for C72H87N5S3：1117.6124. Found：1116.6［MB-H］-）

2.3 实验条件的优化

为获得最佳的检测灵敏度，分别对溶剂THF配比、反应时间和溶液pH值进行优化。如图4A所示，随着溶剂中THF 含量的增大，BTBTN 的荧光强度呈先升高后降低现象，当溶剂THF 和水的体积比为2∶1时，BTBTN对NO的响应能力最强。

为了探究反应时间对探针荧光强度的影响，考察了探针BTBTN分别与不同浓度（8、16、70µmol/L）NO混合后，其荧光强度随时间的变化情况。结果显示，BTBTN与NO在3 min内反应即达到平衡，表明BTBTN可快速与NO结合并产生荧光响应，因此，选择3 min作为探针与NO的反应时间。

pH 值对荧光强度的影响如图4B所示，在pH 6.0～8.0范围内，探针BTBTN 对NO 具有较稳定的荧光响应，表明BTBTN 适用于生理pH 范围内NO 的检测。因此，选择pH 7.4 为HEPES 缓冲液（HEPES buffer-THF/H2O（2∶1））的最佳pH值。

图4 溶剂配比（A）及pH值（B）对荧光强度的影响Fig.4 Effects of volume ratios of THF to water（A）and pH value（B）on fluorescence systems of BTBTN HEPES buffer：0.01 mol/L，BTBTN：5µmol/L

2.4 标准曲线、线性范围与检出限

为了探究荧光探针对NO 的检测灵敏度，测试了BTBTN 与不同浓度（0～50µmol/L）NO 在HEPESTHF 缓冲液（pH 7.4）中的荧光光谱。从图5 可知，探针的荧光强度随着NO 浓度的增加而增加，且BTBTN 在775 nm/640 nm 的荧光强度比值F775nm/F640nm与NO 的浓度在0～10µmol/L 范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y=0.2792+0.3282×［NO］（r2=0.9939），式中［NO］为NO 的浓度（µmol/L），Y为F775nm/F640nm的比值。根据检出限的计算公式（LOD=3σ/k，σ为空白样品连续测定3次的标准偏差，k为标准曲线斜率），测得方法对NO的检出限为28.88 nmol/L。

图5 探针BTBTN 与不同浓度NO 作用后的荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectra of BTBTN upon addition of different concentrations of NOBTBTN：5µmol/L，HEPES buffer-THF/H2O（2∶1），pH 7.4；inset：relationship between NO concentration and fluorescence intensity（F775 nm/F640 nm）

与文献报道的其他NO 探针的检测结果相比（表1），探针BTBTN 对NO 具有较低的检出限。基于本方法对NO响应速度快、检测灵敏度高的特点，可实现对体外NO含量的快速、灵敏的荧光定量检测。

表1 本方法与文献报道的检测NO荧光探针的检出限比较Table 1 Comparison of detection limits of the method with the other fluorescent probes for NO

2.5 选择性实验

为了考察探针BTBTN 对NO 检测的选择性和抗干扰能力，以常见的不同种类分析物作为干扰物，测试了BTBTN 的荧光光谱。检测对象包括：6 种氨基酸（Hcy、GSH、L-Cys、L-Lys、Gly、NAC，浓度均为5.0 mmol/L）、2 种生物小分子（丙酮醛、抗坏血酸，浓度均为50µmol/L）、6 种金属离子（Na+、Ca+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+，浓度均为1.0 mmol/L）、5 种阴离子、Br-、I-，浓度均为1.0 mmol/L）、5种活性氧及活性氮物种（·OH、1O2、ClO-、H2O2、ONOO-，浓度为100µmol/L）。当向5µmol/L BTBTN溶液中加入30µmol/L NO后，其荧光强度比值（F775nm/F640nm）迅速增大。将上述干扰物加入到荧光探针溶液中充分反应后，未观察到F775nm/F640nm的明显变化，表明上述测试物中，只有NO 能触发BTBTN 探针的近红外荧光，表明BTBTN 对NO 检测具有较好的选择性和抗干扰能力，可满足生物样品中NO的检测要求。

3 结论

本文以邻苯二胺修饰的苯并噻二唑衍生物作为NO 识别基团和电子受体，以芴的衍生物作为供电子荧光基团，设计并合成了一种新型近红外比率型荧光分子探针BTBTN。该探针与NO 反应后生成苯并三氮唑结构，分子内电荷转移（ICT）效应增强，荧光发射光谱明显红移，探针在红光区的荧光发射减弱，而在近红外区的荧光明显增强，通过两者间的荧光变化可实现NO 的比率计量检测。探针BTBTN对NO 的荧光检测具有响应快速（3 min）、检出限低（28.88 nmol/L）及在生理pH 范围内稳定性好和选择性高的特征，有望用于复杂细胞和活体环境中NO的定量检测。