新疆阿克苏地区部分猪场流行性腹泻病毒的检测与分析

刘 洋，孙鹏亮，张秋林，陈荟旭，龚学文，李莲瑞

（1.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔 843300；4.阿克苏兴疆牧歌食品股份有限公司，新疆 阿克苏 843000）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种急性、高度传染性肠道疫病，临床特征为呕吐、水样腹泻和脱水死亡[1]，各个年龄阶段的猪群都会发病，尤其是5日龄内哺乳仔猪感染率最高，病死率也最高，几乎为100%[2]。

近年来我国多地猪场冬、春季节发生猪流行性腹泻，给养猪业带来巨大的损失[3]。PEDV毒株对仔猪具有极高的致病性并可急性感染整个小肠和大肠绒毛上皮细胞，以空肠和回肠为主。PEDV感染可引起严重的急性萎缩性肠炎和病毒血症，导致严重的腹泻和呕吐，造成广泛性脱水，最终导致哺乳仔猪死亡[4]。20世纪70年代，PEDV首先在英国与比利时被发现[5-6]，后该病毒流行于欧洲和亚洲多个国家[7-8]。我国在1980年就有该病发生的相关报道[9]，自2010年来，PED在我国多地区暴发[10-12]，2015年又在我国西北地区暴发[1]。PEDV给养猪业造成了巨大的防控风险，也给养殖户及养殖企业带来了很大的经济损失。

PEDV属于冠状病毒科、α冠状病毒属，病毒粒子呈多形性，具有囊膜，其基因组为单股正链RNA，全长约28 kb。主要有纤突蛋白S、囊膜糖蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N以及一种由ORF3基因编码的辅助蛋白。M蛋白是一种跨膜蛋白，该蛋白在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用[13]；另外，冠状病毒的M蛋白能够介导机体产生α-干扰素（α-IFN）[14]。M基因比较保守，是研究PEDV遗传演化的优先选择基因，对PEDV增殖情况的研究以及PED的诊断和防治具有重要意义。

近年来新疆地区不断出现PED暴发的案例，2011—2012年间新疆地区北疆4家猪场、南疆6家猪场共计10家猪场发病[15]，2013—2015年间石河子及周边地区29个猪场发生腹泻情况，其中22个猪场PED检测阳性[16]，2018—2019年间新疆石河子、五家渠、乌鲁木齐6个不同地区25个猪场发病，采集1 388份样品，PED检测阳性率达到了46.69%[17]。鉴于此，本研究采集阿克苏地区某猪场的疑似PEDV感染的猪病料组织，进行M基因克隆与分析，为该地区PED的防控奠定基础。

1 材料

1.1 样品来源

样品采集于新疆阿克苏地区某猪场，采集疑似患有猪流行性腹泻的7日龄以内仔猪的肠道内容物，并置于-70 ℃冰箱中保存、备用。2021年3月在塔里木大学动物科学与技术学院进行检测。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒（ER201）、反转录试剂盒（AE311），购自TransGen Biotech公司；质粒小提试剂盒、Gold view核酸染料、DL 2 000 Marker，购自北京天根生化科技有限公司；pMD19-T Vector，购自大连宝生物工程有限公司；氨苄西林，购自大连美仑生物技术有限公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DC301），购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3 主要仪器

小型高速冷冻离心机（Centrifuge 541 5R）购自Eppendorf科技有限公司；台式微量高速离心机（Sorvall Legend Micro 17）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；恒温培养箱（GHP-9080）购自上海一恒科学仪器有限公司；水浴恒温振荡器（THZ-S2A）购自常州奥华仪器有限公司；洁净工作台（SW-CJ-2ED）购自上海博讯实业有限公司；PCR仪（TC-5000）购自英国TECHNE公司；水平电泳槽（Thermal cycler Block）购自Thermo Fisher公司；凝集成像系统（Gel DocTM XR+）购自Bio-RAD公司；高压灭菌锅（HVE-50）购自日本TOMY KOGYO公司；电子分析天平（AUY220）购自杭州汇尔仪器设备有限公司。

2 试验方法

2.1 样品处理与其总RNA的提取

猪肠道内容物的总RNA的提取参照TransGen Biotech公司RNA提取试剂盒说明书（ER201）的要求进行操作，提取样品中的总RNA，其逆转录参照TransGen Biotech公司RNA反转录试剂盒说明书（AE311）进行操作，将获得的cDNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存，备用。

2.2 引物的设计

参照NCBI（GenBank登录号：MN692793）的PEDV序列信息，设计PEDV M基因特异性片段鉴定的引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

引物序列为：上游引物5'-GGCGAATTCCGGT TCTATTCCCGTTGATG-3'，下游引物5'-GGCCTCG AGATGAAGCACTTTCTCACTAT-3'，预计扩增片段大小为663 bp。

2.3 PCR扩增目的基因

在PCR管中，加入cDNA 1 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，EasyTaq Super Mix 12.5 μL，用Nuclease-free Water补齐至25 μL；PCR扩增程序为94 ℃预变性300 s；94 ℃变性50 s，56 ℃退火60 s；72 ℃延伸60 s；35个循环；72 ℃保护延伸600 s。PCR结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察目的条带并对其拍照保存。

2.4 M基因的克隆及测序和序列分析

PCR产物进行回收与纯化，连接pMD-19T载体，转化DH5α，PCR鉴定后的阳性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果与GenBank中的30个PEDV分离株的基因序列进行BLAST比对，并使用软件MEGA 6.0对其构建系统遗传进化树，进一步判断其与国内外其它毒株的遗传进化关系。试验所用参考毒株序列见表1。

表1 参考毒株相关信息

3 结果与分析

样品总RNA的提取参照TransGen Biotech公司RNA提取试剂盒说明书（ER201）的要求进行操作，RNA提取结果如图1所示。将提取的总RNA参照TransGen Biotech公司RNA反转录试剂盒说明书（AE311）反转录成cDNA，将获得的cDNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存，备用。

图1 样品RNA基因电泳

3.1 M基因的PCR扩增、克隆和测序结果

以样品的cDNA为模板，扩增M基因，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示：样品中扩增出了大小约为663 bp的基因片段，与预期片段大小相符，电泳结果见图2。PCR产物进行回收与纯化，连接pMD-19T载体，转化DH5α，阳性克隆的鉴定结果见图3。PCR鉴定后的阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

图2 M基因的PCR扩增结果

图3 阳性克隆的PCR鉴定结果

3.2 PEDV特征基因片段的序列分析结果（系统进化树分析及同源性比较）

使用MEGA 6.0将该毒株的测序结果与GenBank中的30个参考毒株（15个全基因组毒株，15个M基因毒株）构建遗传进化树如图4所示，从图4中可以看出，该毒株与国内绝大部分毒株（9个M基因毒株，5个全基因组毒株），如：2012年河北M基因分离株HBMC2012（GenBank登录号：JX163295），2012年福建M基因分离株FJ-LY12021（GenBank登录号：KJ646600），2013年贵州M基因分离株ZY（GenBank登录号：KF150217），2014年浙江全基因组分离株CH/JXZS-3L（GenBank登录号：KF840547），2018年甘肃全基因组分离株CH/HNYY/2018（GenBank登录号：MT090145）等属于同一个群（Ⅰ群），亲缘关系较近，处于同一分支；与部分国外毒株（5个全基因组毒株），如2018年匈牙利分离株S236（GenBank登录号：MH593900），2019年德国分离株GER/L032205/2019（GenBank登录号：LR812932），2019年法国分离株FR2019001（GenBank登录号：MN056942）等属于同一个群（Ⅰ群），亲缘关系较近，处于同一分支。该毒株与国内外部分毒株（6个M基因毒株，5个全基因组毒株），如2007年河南M基因分离株YM-2007（GenBank登录号：EU302820），2000年韩国M基因分离株KPEDV-9（GenBank登录号：AF015888），经典毒株CV777（GenBank登录号：AF353511），该猪场所用疫苗株AJ1102（GenBank登录号：JX188454）等处于不同分支，亲缘关系较远。说明该毒株与2011年后国内外主要分离株M基因差异不大，与经典毒株CV777、疫苗株AJ1102及国内外早期分离株差异较大。

图4 流行性腹泻病毒M基因进化树

根据测序结果，将该毒株的测序结果与GenBank中的30个参考毒株（15个全基因组毒株，15个M基因毒株）进行同源性分析，结果如图5所示。该毒株与进化树中Ⅰ群的同源性较高，同源性为98.8%～99.5%。其中与2012年北京M基因分离株GDZQ-1024（GenBank登录号：KC294274）、2012年北京M基因分离株TJNH-1023（GenBank登录号：KC294273）同源性最低，同源性为98.8%；与2012年福建M基因分离株FJ-LY12012（GenBank登录号：KJ646600）、2014年浙江全基因组分离株CH/JXZS-3L（GenBank登录号：KF940547）、2019年西班牙全基因组分离株PEDV-1931-1（GenBank登录号：MN692784）等同源性最高，同源性为99.5%。该毒株与进化树中Ⅱ群的同源性较低，同源性为96.7%～98.8%。其中与2011年福建M基因分离株FJ/PT/2011（GenBank登录号：JQ678036）同源性最低，同源性为96.7%；与2004年江苏M基因分离株JS-2004-2（GenBank登录号：AY653205）同源性最高，同源性为98.8%；与经典毒株CV777（GenBank登录号：AF353511）的同源性为97.6%；与疫苗株AJ1102（GenBank登录号：JX188454）同源性为98%。以上结果均证明该毒株与2011年后国内外主要分离株M基因差异不大，与经典毒株CV777、疫苗株AJ1102及国内外早期分离株差异较大。推测该猪场发病可能是疫苗株和该场毒株不完全匹配，没有提供较高保护力所致。

图5 不同PED毒株的M基因的同源性分析及比较

4 讨论

该案例发生在2020年10月份，产房仔猪以水样腹泻为主，严重脱水，发病日龄小，14日龄以下死亡率达到50%。经过前期的流行病学调查，得知该猪场采用4周批的生产模式，腹泻苗的免疫对象主要为妊娠母猪和后备猪[18-19]，但在后备猪阶段未进行系统性的驯化。该猪场PED的妊娠母猪阶段免疫程序相对比较完善，自2018年以来就没再发生改动，妊娠母猪的免疫分为跟胎免疫和全年普免。跟胎免疫分别是在产前30 d进行活苗+灭活苗的免疫，在产前10 d进行灭活苗的免疫，总共免疫两次；全年普免分别是在3月份和6月份各进行1次活苗+灭活苗的免疫，总共免疫两次（中间间隔6个月）。后备母猪阶段免疫程序有所不足，分别在140日龄进行活疫苗的免疫和160日龄进行灭活苗的免疫。免疫所使用的疫苗均为TGE-PED（WH-1株+AJ1102株）二联苗。总体来说PEDV的免疫程序是相对完善的，但该猪场所用疫苗株与该场毒株不是完全匹配，可能存在所使用疫苗不能给猪群提供有效保护力的情况。另外该猪场在10月份所进行生产的母猪群结构是经产母猪和后备母猪混合的结构，发病也多是从后备母猪所生产的仔猪开始。分析认为虽然母猪经过疫苗免疫，但由于母猪群结构复杂、后备母猪免疫次数较少不能给其所产仔猪提供有效的保护力，更容易感染发病。这些仔猪发病后会进行排毒，导致猪舍内病毒载量突然升高，经产母猪所产仔猪虽然能得到一定保护，但由于猪舍内病毒载量过高，导致经产母猪所产仔猪也被感染，再次进行排毒，周而复始，使猪舍内病毒载量不断积累升高，进而导致整体猪群感染发病[20]。

通过对猪场疑似猪流行性腹泻病毒的M蛋白的基因进行检测，检测到阳性样本，基因经克隆后测序，发现该基因片段与2011年后国内外分离株（CH/HNYY/2018，CH/JXZS-3L，FJ-LY12012，C3-HB2017，GER/L03207，GER/L03205，S236，FR2019001，PEDV-1931-1）的同源性均较高，均为99.5%。这说明2011年后国内外PEDV的主要分离株M基因差异不大[21]，这与卢冰霞等[22]、张红垒等[23]、王隆柏等[24]研究结果基本一致。

除了用M基因分析外，也有不少学者先后采用ORF3、N基因进行PEDV的同源进化分析，结果也不尽相同[25-27]，但由于M基因比较保守，因此仍是研究PEDV遗传演化的优先选择基因。由于本次分离的PEDV来自已经免疫过猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联疫苗的猪场，因此，有必要继续深入研究这些流行毒株的生物学特性和免疫特性。

猪流行性腹泻的治疗目前无特效方案，控制该疫病以预防为主。主要从生物安全、疫苗免疫、饲养管理防控3个方面入手进行防控。目前，市面上的TGE-PED二联苗有一定预防效果，但变异病毒用疫苗预防效果差，现有的疫苗无法对新的变异毒株产生较好的保护，是本病难以得到有效防控的重要原因之一。因此该猪场还需要制定出系统性的可实施的有效方案，来加强后备猪的驯化管理，使后备母猪能给其所产的仔猪提供有效的保护，防止猪群再次发病[27]。通过本次试验可以得出阿克苏某猪场采集的疑似发病样本存在猪流行性腹泻病毒感染，为该猪场在猪流行性腹泻病毒的检测、免疫和防控方面提供理论依据及指导。

5 结论

本试验发现，该猪场毒株和湖北分离株C3-HB2017亲缘关系最近，在进化树上同处于一个小分支，且同源性为99.5%，但仍存在3个碱基位点的突变；与2011年以后国内外主要分离株M基因亲缘关系较近，在进化树上虽不处于同一分支，但都属于同一个大群（Ⅰ群），同源性为98.8%～99.5%。但与经典毒株CV777和疫苗株AJ1102（2012年湖北分离株）亲缘关系相对较远，在进化树上既不处于同一分支，也不属于同一个群；该毒株与经典株CV777同源性为97.6%，存在16个碱基位点的突变，与疫苗株AJ1102同源性为98%，存在13个碱基位点的突变。说明该场猪流行性腹泻流行毒株可能为变异毒株。