山西平陆野葛根愈伤组织诱导与培养条件筛选

张 静，王刚狮，刘瑞霞，时宝凌，廉梅霞

（山西林业职业技术学院，山西 太原 030009）

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料选用新鲜采挖的山西运城平陆县野生葛根Pueraria lobata（Willd.）Ohwi作为外植体。试剂为植物激素：2,4-D，6-BA，KT；蔗糖，琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 MS、B5基本培养基诱导野葛根愈伤组织情况

选择直径约1 cm、外表皮无破损的根，切成10 cm 的长段，进行外植体消毒。先放入75% 的酒精溶液中30 s，用镊子取出后，再倒入0.2% 的HgCl2水溶液中浸泡8 min，取出后用无菌水冲洗5～6 次。在超净工作台将灭菌后的根段切成0.5 cm 长的小段，接种于B5培养基和MS培养基中，激素种类和浓度一致，均为2 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L KT。2 种培养基分别接种20 瓶，每瓶4 段外植体，置于培养箱中，条件为25℃、黑暗培养。每隔3 d 观察培养情况，记录生长状况，30 d 后统计诱导率。

1.2.2 不同外源植物激素的添加对野葛愈伤组织诱导情况

在MS 基本培养基中添加外源激素，分别为2,4-D、6-BA、KT、NAA，激素的配比和浓度见正交试验表1。试验重复3次。

表1 外源植物激素对野葛愈伤组织诱导影响正交试验Tab.1 The orthogonal effects of exogenous phytohormones on induction of wild callus

1.2.3 愈伤组织生长曲线绘制及不同时期总黄酮含量测定

称取上一步培养的愈伤组织1.0±0.1 g，要求质地松软，长势良好。接种于继代培养基中，培养基配方为：MS+蔗糖3%+0.6% 琼脂+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT。培养条件不变，黑暗、25℃。共接种90 瓶。培养周期为30 d，每隔2 d 取出6 瓶，用天平称量愈伤组织的鲜质量并记录。之后低温烘干，取0.2 g 粉末，放入具塞锥形瓶中，加入20 mL 70% 的酒精，超声波处理30 min，温度为70℃，冷却、过滤，等浓度的酒精定容至20 mL容量瓶中，用分光光度法测定吸光度，计算总黄酮含量。

1.2.4 光照条件对愈伤组织生长及总黄酮合成的影响

将接种的愈伤组织90 瓶，平均分成3 组。每组采用不同的光照周期：分别为24 h光照、16 h光照+8 h黑暗、24 h黑暗。培养30 d 后，称量愈伤组织鲜质量，记录。低温烘干，提取、分光光度法测定不同光照时间对总黄酮含量的影响。

2 结果

2.1 基本培养基对野葛根愈伤组织诱导的影响

根据外植体出愈时间、愈伤组织诱导率、愈伤组织细胞状态来评价愈伤组织诱效果。由表2可知：MS基本培养基诱导愈伤组织的效果最好，诱导率为95%。接种外植体后的第10 d，在根的横断面、去掉表皮的根表面，均长出淡黄色、质地松软的愈伤组织图1（1）。在培养25 d时，愈伤组织数量明显增多，细胞疏松，分散性好，颜色鲜艳，质地软嫩。相比较B5培养基中的愈伤组织，出现时间较晚，在18 d 才初露少量的细胞，后期生长速度缓慢，分散性差，颜色为黄褐色。

表2 基本培养基对野葛根愈伤组织诱导的影响Tab.2 The effects of basic media on induction of callus

2.2 不同植物激素对野葛根愈伤组织诱导的影响

使用SPSS19.0进行数据极差分析，见表3。

由表3极差R可知，2,4-D是影响野葛根愈伤组织诱导的最主要影响因素。最优激素组合为：A3B2C2D2。即：2.0 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L KT+ 1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA。

表3 不同激素对野葛愈伤组织诱导的影响Tab.3 The effects of different hormones on induction of callus

2.3 愈伤组织生长曲线与不同时期总黄酮含量测定

在接种10 d 后，外植体的断面开始形成黄白色的愈伤组织，在生长17 d时体积增大一倍，鲜质量为2.74 g，见图1（2），在生长26 d 时，愈伤组织几乎扩张至整瓶，鲜质量高达为7.51 g，见图1（3）；在培养28 d后，愈伤组织细胞停止生长，甚至有些开始死亡，颜色由淡黄色转变为黄褐色，鲜质量在30 d时下降为6.67 g，见图1（4）。生长曲线见图2。

由图2 可知：0～10 d 为愈伤组织生长的延滞期，10～22 d为愈伤组织指数生长期，22～26 d 为稳定期，26～30 d 为衰亡期。总黄酮的含量与细胞生长量呈正相关。延滞期总黄酮含量最低，为1.35%；在指数生长期，总黄酮含量迅速增高，在26 d时含量高达15.17%；到衰亡期总黄酮含量开始下降。

图2 野葛根愈伤组织生长曲线与总黄酮含量变化Fig.2 The growth curve and callus total flavonoids content

2.4 光照时间对愈伤组织生长及总黄酮合成的影响

由图3可知：在光照24 h条件下，愈伤组织颜色为黄褐色图1（5），鲜质量为7.56 g，总黄酮含量为16.75%。24 h黑暗条件下，愈伤组织为黄白色图1（6），鲜质量6.3 g，总黄酮含量为14.83%。在16 h 光照+8 h 黑暗条件培养下，愈伤组织为淡黄色图1（7），鲜质量为7.60 g，总黄酮含量为15.30%。因此，最适合愈伤组织培养的条件为16 h光照+8 h黑暗。

图1 愈伤组织变化Fig.1 The changes of callus

图3 光照时间对野葛细胞生长及总黄酮合成的影响Fig.3 The effects of light time on wild Ge cell growth and total flavonoid synthesis

3 讨论

3.1 最适合野葛根愈伤组织诱导的培养基为MS 基本培养基

基本培养基的作用是为植物细胞提供基本的营养，常用的基本培养基有4 中MS、B5、N6 和White。其中MS 培养基在组织培养中被广泛使用，因为其具有较高浓度的无机盐。而B5培养基中铵盐含量低，适用于双子叶植物的组织培养以及悬浮细胞培养[1]；N6 培养基中营养成分简单，氮源含量低，适用于谷类植物的花药培养；White 培养基中无机盐浓度低，一般用于生根培养[2]。

本试验选取MS 和B5 基本培养基进行筛选。结果表明：在愈伤组织诱导阶段，MS 培养基产生的愈伤组织诱导率高，细胞分散性好，是理想的愈伤组织诱导培养基。

3.2 多种激素协同作用可以提高愈伤组织的诱导率

一般情况下，在培养基中外植体脱分化形成愈伤组织，与所添加的外源植物激素的种类、浓度和配比有很大的关系。外源激素起着传递信号的作用，其作用效果与外植体中内源激素的种类和浓度密切相关，外源激素通过内源激素发挥作用[3]。因此，只有合理地使用各种外源激素，才能适应外植体对激素的特定要求，充分发挥激素的调节作用，从而诱导愈伤组织的产生[4]。

2,4-D对于愈伤组织的诱导和生长非常有效[5]，一般情况下，诱导产生愈伤组织的2,4-D 的浓度多为0.1～2.0 mg/L。在本试验中，单纯使用2,4-D 时，愈伤组织可以快速形成，但细胞呈黏液化，因此，需要与其他的细胞分裂素一起使用，保证细胞呈现很好的颗粒状与分散性。NAA 虽然不是愈伤组织诱导中重要的植物激素，但很多研究表明，NAA 对愈伤组织的诱导也有很重要的影响。林娅等[6]和龙雯虹[7]分别发现在月季和萝卜愈伤组织的诱导中NAA的效果优于2,4-D；田文忠[8]在含2.0 mg/L 2,4-D 的培养基中添加1.0 mg/L KT 和1.0 mg/L NAA后，愈伤组织不再粘液化，并且颗粒增多。因此，本试验选择将NAA 作为诱导愈伤组织的激素，与2,4-D、KT 一起使用，得到了分散性好的疏松、颗粒状的愈伤组织。

3.3 在愈伤组织指数生长末期总黄酮含量最高

愈伤组织的生长过程是细胞分裂的过程，而细胞的分裂需要培养基为其提供养分，随着细胞量的增多，培养基中的养分会逐渐消耗，锥形瓶的空间也会逐渐减小，而细胞的代谢产物随着细胞生长的积累也会逐渐增多，过多的次级代谢产物又会对细胞造成伤害，因此，为了确定最适的继代培养周期，本试验对细胞的生长曲线进行了测定。

植物细胞的生长进程大致相同，生长曲线呈“S”型。包括4 个时期：①延迟期。指刚接入培养基的细胞还未适应新的环境，细胞生长缓慢的时期。②指数生长期。指经过延迟期的适应，加之培养基中营养充足，细胞迅速生长的时期。③稳定期。指随着营养物质逐渐被消耗，细胞生长速度减缓，细胞的死亡率等于生长率的时期。④衰亡期。指培养基中营养物质消耗殆尽，细胞死亡率大于生长率的时期[9]。在本研究中通过愈伤组织生长曲线，可以看出野葛愈伤组织的停滞期较长，为10 d；整个生长周期为28 d左右，总黄酮在26 d左右达到最大。这一结果与陈刚等[10]的研究结果相一致。在药用植物细胞培养中，细胞一般会在指数生长期后期，由初生代谢进入次生代谢[11]，因而在稳定期末期可以获得最高的次级代谢产物量。

3.4 光周期培养有利于野葛愈伤组织生长与总黄酮的合成

光不仅是植物进行光合作用的能量来源，也作为重要的环境信号调节植物的基因表达、影响酶活性以及植物的形态建成等[2]。光照对药用植物细胞培养的影响主要体现在光质、光强和光照时间上[12]。许多研究均表明，光照有利于植物细胞中黄酮物质的合成。如陈学森[13]将银杏愈伤组织在不同光照条件下培养后，发现光照培养所得黄酮是暗培养的3 倍。许多研究[14]也证明光照可以加强黄酮生物合成过程中的关键酶（PAL）的活性。但是，光照时间过长会引起胁迫，导致产生酚类化合物，导致褐化的发生。因此，获得高生物量和获得高次级代谢产物的条件往往是矛盾的，寻找恰当的光周期是获得高产与高效成分的关键。本研究的光周期为16 h光照+8 h黑暗此时，生物量与总黄酮含量均较高。